發(fā)布時(shí)間：2020-01-29 13:36

【摘要】：目的在CHO細(xì)胞中表達(dá)抗人腫瘤壞死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源單克隆抗體,并對(duì)抗體純化后進(jìn)行鑒定。方法將含有編碼抗h TNF-α人源單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)及恒定區(qū)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒p HL,利用脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染CHODG44細(xì)胞,經(jīng)氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加壓篩選和單克隆篩選,獲得分泌表達(dá)抗h TNF-α人源單克隆抗體的CHO細(xì)胞株。應(yīng)用Mab Select Su Re和Capto adhere兩步層析純化抗體后,分析抗體的純度、N-末端序列、結(jié)合動(dòng)力學(xué)平衡常數(shù)及中和活性。結(jié)果經(jīng)兩步層析后,抗h TNF-α人源單抗經(jīng)SDS-PAGE分析,可見(jiàn)純度較好的抗體重鏈、輕鏈和完整抗體條帶,SEC-HPLC純度為98.79%;抗體的輕、重鏈N-末端氨基酸序列與預(yù)期一致,其結(jié)合動(dòng)力學(xué)平衡常數(shù)(KD)為1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用,對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的中和率達(dá)90%左右。結(jié)論在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)了具有較好中和活性的抗h TNF-α人源單克隆抗體。
【圖文】：

中國(guó)生物制品學(xué)雜志2014年12月第27卷第12期ChinJBiologicalsDecember2014，Vol.27No.12本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）篩選系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)抗hTNF-α人源單抗的CHO細(xì)胞株，并對(duì)抗體純化后進(jìn)行初步鑒定。1材料與方法1.1細(xì)胞及質(zhì)粒CHO-DG44細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；L929細(xì)胞和含編碼抗hTNF-α人源單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)及恒定區(qū)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pHL（圖1）為北京生物制品研究所有限責(zé)任公司第三研究室保存。圖1質(zhì)粒pHL圖譜Fig1.MapofplasmidpHL1.2主要試劑及儀器CDFORTICHOMedium、HTmediasupplement和LipofectamineTM2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PvuⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）、放線菌素D和MTT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；重組TNF-α購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；MabSelectSuRe和Captoadhere層析柱、HBS-EP、乙醇胺、CM5傳感芯片和BIAcore3000系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)GEHealthcare公司；HPLC系統(tǒng)購(gòu)自日本島津公司；色譜柱Protein-Pak300SW購(gòu)自美國(guó)WATERS公司。1.3抗hTNF-α人源單抗CHO表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建將CHO-DG44細(xì)胞按3×105個(gè)／ml的密度接種于125ml三角瓶中，將經(jīng)內(nèi)切酶PvuⅠ線性化的質(zhì)粒pHL（30μg）與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000混合，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，用含HTmediasupplement的CDFORTICHO培養(yǎng)基，于37℃，8％CO2，130r／min懸浮培養(yǎng)48h；再用CDFORTICHO培養(yǎng)基（不含HT）進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，MTX加壓篩選，有限稀釋法挑選單克隆，獲得分泌表達(dá)抗hTNF-α人源單抗的CHO細(xì)胞株。1.4抗hTNF-α人源單抗的表達(dá)和純化將抗hTNF-α人源單抗穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株按3×105個(gè)／ml的密度接種于1L三角瓶中，，用CDFORTICHO培養(yǎng)基，于37℃，8％CO2，130r／

第27卷第12期ChinJBiologicalsDecember2014，Vol.27No.12和Captoadhere層析兩步純化抗體，獲得較純的抗hTNF-α人源單抗，見(jiàn)圖3～5。2.2抗hTNF-α人源單抗的純度2.2.1SDS-PAGE分析純化的抗hTNF-α人源單抗經(jīng)12%SDS-PAGE分析，可見(jiàn)純度較好的抗體重鏈、輕鏈和完整抗體條帶，見(jiàn)圖6。圖2表達(dá)抗hTNF-α人源單抗的CHO細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線Fig2.GrowthcurveofCHOcellsexpressinghumanmono－clonalantibodyagainsthTNF-α圖3MabSelectSuRe層析結(jié)果Fig3.MabSelectSuRechromatogramofhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α圖4Captoadhere層析結(jié)果Fig4.CaptoadherechromatogramofhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-αM：蛋白質(zhì)marker；1：培養(yǎng)上清；2：親和流穿；3，4：親和洗脫；5：adhere流穿。圖5純化各步樣品的還原SDS-PAGE分析Fig5.ReducedSDS-PAGEprofileofsamplesatvariousstepsofpurificationM：蛋白質(zhì)marker；1：還原；2：非還原。圖6純化的抗hTNF-α人源單抗的SDS-PAGE分析Fig6.SDS-PAGEprofileofpurifiedhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α2.2.2SEC-HPLC分析經(jīng)測(cè)定，抗hTNF-α人源單抗的SEC-HPLC純度為98.79%，見(jiàn)圖7。圖7純化的抗hTNF-α人源單抗的SEC-HPLC分析Fig7.SEC-HPLCprofileofpurifiedhumanmonoclonalantibodyagainsthTNF-α2.3抗hTNF-α人源單抗的N-末端氨基酸序列測(cè)序結(jié)果顯示，抗hTNF-α人源單抗的輕鏈N-末端序列為DIQMTQSPSSLSASV，重鏈N-末端序列為EVQLVESGGGLVQPG，與預(yù)期輕、重鏈N-末端氨基酸序列一致。表明抗體完全表達(dá)，且信號(hào)肽剪切正確。02468101214時(shí)間（d）020406080100120細(xì)胞活率（%）活細(xì)胞數(shù)（×106）01234567

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