【摘要】： 腱/韌帶是堅韌的結締組織,通過其結構、力學性質和外形的變化以響應外力的刺激,在運動中起著重要作用,但活動范圍超過極限或拉扯過劇,腱/韌帶都會受到損傷甚至斷裂,嚴重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題,比如如何加快治療速度、提高治療質量直至完全治愈等等,都是臨床上亟待解決的難題。 骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有增殖和多分化潛能的特殊細胞。在特異誘導條件作用下,骨髓間充質干細胞在體外可增殖并定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌肉細胞等,這種分化可塑性為彌補臨床上腱/韌帶組織的缺乏和腱/韌帶創(chuàng)傷的愈合帶來了希望,但對于胞外基質是否能誘導骨髓間充質干細胞向腱/韌帶成纖維細胞定向分化以及分化的適宜條件,至今尚沒有系統(tǒng)研究報道。為此,本文以大鼠骨髓間充質干細胞(Rat marrow mesenchymal stem cells, rMSCs)為研究對象,采用肌腱細胞胞外基質的主要成分I型膠原蛋白(Collagen I)和彈性蛋白(Elastin)分別對骨髓干細胞進行誘導培養(yǎng),考察了Collagen I和Elastin誘導大鼠骨髓干細胞向腱/韌帶成纖維細胞定向分化的條件。主要研究工作和結果如下: 1.大鼠骨髓間充質干細胞的原代分離培養(yǎng) 利用密度梯度離心結合差異貼壁法進行大鼠骨髓間充質干細胞的原代分離培養(yǎng),結果表明:1.073g/ml的percoll密度梯度離心結合差異貼壁分離得到的細胞為形態(tài)比較均一的單核細胞,用含15%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后細胞開始貼壁,繼而分裂增殖,呈集落式生長,約2周后細胞接近融合,呈紡錘形或長梭形的成纖維細胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細胞等,在反復換液中被除去。傳代細胞貼壁、生長較快,約一周可達到融合,呈長梭形或紡錘形均勻分布。細胞核漿比較大,姬姆沙染色胞核呈圓形或橢圓形,為紫色,可見數個深紫色的核仁,胞漿為淡紫色。 2.大鼠骨髓間充質干細胞的鑒定和周期分析 利用免疫染色方法考查了分離培養(yǎng)的細胞表面部分抗原的表達,利用流式細胞技術分析了細胞周期的分布。結果發(fā)現:細胞表面抗原CD34(造血干細胞標記物)呈陰性;CD44和CD29呈陽性表達。細胞周期分析顯示G0/G1期細胞占(89.74±3.87)%,S期細胞占(2.49±2.2)%,G2/M期細胞占(7.7±3.7)%,表明大部分細胞處于非增殖狀態(tài)。 3. Collagen I對大鼠骨髓間充質干細胞定向分化的誘導 考查了不同濃度的Collagen I對大鼠骨髓干細胞選擇分化的誘導作用,利用RT-PCR技術定量檢測了誘導7天、14天和21天過程中Collagen I、Collagen III和腱/韌帶成纖維細胞特異標志基因Scleraxis mRNA水平的表達。結果表明:不同濃度Collagen I誘導細胞分化7天Collagen I、Collagen III都有不同程度的表達,而Scleraxis的表達并不明顯。誘導14天后Collagen I、Collagen III和Scleraxis相對表達量出現一個峰值,21天后表達量又開始呈現下降趨勢。比較而言,100μg/ml的Collagen I誘導14天,Collagen I、Collagen III和Scleraxis mRNA水平的表達呈現較高的水平。 4. Elastin對大鼠骨髓間充質干細胞定向分化的誘導 采取同樣的方法考查了不同濃度的Elastin對大鼠骨髓間充質干細胞選擇分化的誘導作用。結果表明: Elastin刺激rMSCs 7天后Collagen I、Collagen III有少量表達。與Collagen I誘導有所不同的是,作用7天后Scleraxis就開始表達,作用14天后各個基因的相對表達量達到最大,作用21天后表達量出現下調。20μg/mL Elastin的誘導效果相對較好,作用效果更為明顯。 本文研究結果表明,胞外基質Collagen I和Elastin對大鼠骨髓間充質干細胞的選擇分化起著重要的調節(jié)作用,在適宜條件下可誘導骨髓間充質干細胞向腱/韌帶成纖維細胞定向分化。這些研究不僅對認識骨髓間充質干細胞自我更新、分化的分子調控機制及其相關規(guī)律有重要意義,而且為腱/韌帶損傷的臨床治療和腱/韌帶的組織工程化研究提供了理論參考和方法學借鑒。
【圖文】：

2.3 實驗結果2.3.1 大鼠 MSCs 的分離培養(yǎng)離心后可以見到明顯的四層，從上到下依次為：血小板層、白膜層、Percoll層、紅細胞及多核白細胞層，其中白膜層為單個核細胞層。小心吸取白膜層，離心洗滌，接種于 LG-DMEM 完全培養(yǎng)基中。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現：剛接種的細胞呈圓形，個體較小，大小不均一，數量較多，處于懸浮狀態(tài)。24h 后可觀察到部分細胞貼壁，大部分為圓形，核漿清晰，基本上都為單核，位于細胞中央，折光率較大。72h 可以觀察到大部分呈梭形纖維狀，也有部分呈三角形和星形。有

2.3 實驗結果2.3.1 大鼠 MSCs 的分離培養(yǎng)離心后可以見到明顯的四層，，從上到下依次為：血小板層、白膜層、Percoll層、紅細胞及多核白細胞層，其中白膜層為單個核細胞層。小心吸取白膜層，離心洗滌，接種于 LG-DMEM 完全培養(yǎng)基中。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現：剛接種的細胞呈圓形，個體較小，大小不均一，數量較多，處于懸浮狀態(tài)。24h 后可觀察到部分細胞貼壁，大部分為圓形，核漿清晰，基本上都為單核，位于細胞中央，折光率較大。72h 可以觀察到大部分呈梭形纖維狀，也有部分呈三角形和星形。有
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2573876