【摘要】： 腱/韌帶是堅韌的結(jié)締組織,通過其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和外形的變化以響應(yīng)外力的刺激,在運(yùn)動中起著重要作用,但活動范圍超過極限或拉扯過劇,腱/韌帶都會受到損傷甚至斷裂,嚴(yán)重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題,比如如何加快治療速度、提高治療質(zhì)量直至完全治愈等等,都是臨床上亟待解決的難題。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有增殖和多分化潛能的特殊細(xì)胞。在特異誘導(dǎo)條件作用下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可增殖并定向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等,這種分化可塑性為彌補(bǔ)臨床上腱/韌帶組織的缺乏和腱/韌帶創(chuàng)傷的愈合帶來了希望,但對于胞外基質(zhì)是否能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腱/韌帶成纖維細(xì)胞定向分化以及分化的適宜條件,至今尚沒有系統(tǒng)研究報道。為此,本文以大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Rat marrow mesenchymal stem cells, rMSCs)為研究對象,采用肌腱細(xì)胞胞外基質(zhì)的主要成分I型膠原蛋白(Collagen I)和彈性蛋白(Elastin)分別對骨髓干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),考察了Collagen I和Elastin誘導(dǎo)大鼠骨髓干細(xì)胞向腱/韌帶成纖維細(xì)胞定向分化的條件。主要研究工作和結(jié)果如下: 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng) 利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離培養(yǎng),結(jié)果表明:1.073g/ml的percoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細(xì)胞為形態(tài)比較均一的單核細(xì)胞,用含15%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后細(xì)胞開始貼壁,繼而分裂增殖,呈集落式生長,約2周后細(xì)胞接近融合,呈紡錘形或長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細(xì)胞等,在反復(fù)換液中被除去。傳代細(xì)胞貼壁、生長較快,約一周可達(dá)到融合,呈長梭形或紡錘形均勻分布。細(xì)胞核漿比較大,姬姆沙染色胞核呈圓形或橢圓形,為紫色,可見數(shù)個深紫色的核仁,胞漿為淡紫色。 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定和周期分析 利用免疫染色方法考查了分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面部分抗原的表達(dá),利用流式細(xì)胞技術(shù)分析了細(xì)胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞表面抗原CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)呈陰性;CD44和CD29呈陽性表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞占(89.74±3.87)%,S期細(xì)胞占(2.49±2.2)%,G2/M期細(xì)胞占(7.7±3.7)%,表明大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。 3. Collagen I對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo) 考查了不同濃度的Collagen I對大鼠骨髓干細(xì)胞選擇分化的誘導(dǎo)作用,利用RT-PCR技術(shù)定量檢測了誘導(dǎo)7天、14天和21天過程中Collagen I、Collagen III和腱/韌帶成纖維細(xì)胞特異標(biāo)志基因Scleraxis mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果表明:不同濃度Collagen I誘導(dǎo)細(xì)胞分化7天Collagen I、Collagen III都有不同程度的表達(dá),而Scleraxis的表達(dá)并不明顯。誘導(dǎo)14天后Collagen I、Collagen III和Scleraxis相對表達(dá)量出現(xiàn)一個峰值,21天后表達(dá)量又開始呈現(xiàn)下降趨勢。比較而言,100μg/ml的Collagen I誘導(dǎo)14天,Collagen I、Collagen III和Scleraxis mRNA水平的表達(dá)呈現(xiàn)較高的水平。 4. Elastin對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo) 采取同樣的方法考查了不同濃度的Elastin對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞選擇分化的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明: Elastin刺激rMSCs 7天后Collagen I、Collagen III有少量表達(dá)。與Collagen I誘導(dǎo)有所不同的是,作用7天后Scleraxis就開始表達(dá),作用14天后各個基因的相對表達(dá)量達(dá)到最大,作用21天后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。20μg/mL Elastin的誘導(dǎo)效果相對較好,作用效果更為明顯。 本文研究結(jié)果表明,胞外基質(zhì)Collagen I和Elastin對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的選擇分化起著重要的調(diào)節(jié)作用,在適宜條件下可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腱/韌帶成纖維細(xì)胞定向分化。這些研究不僅對認(rèn)識骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新、分化的分子調(diào)控機(jī)制及其相關(guān)規(guī)律有重要意義,而且為腱/韌帶損傷的臨床治療和腱/韌帶的組織工程化研究提供了理論參考和方法學(xué)借鑒。
【圖文】：

2.3 實驗結(jié)果2.3.1 大鼠 MSCs 的分離培養(yǎng)離心后可以見到明顯的四層，從上到下依次為：血小板層、白膜層、Percoll層、紅細(xì)胞及多核白細(xì)胞層，其中白膜層為單個核細(xì)胞層。小心吸取白膜層，離心洗滌，接種于 LG-DMEM 完全培養(yǎng)基中。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：剛接種的細(xì)胞呈圓形，個體較小，大小不均一，數(shù)量較多，處于懸浮狀態(tài)。24h 后可觀察到部分細(xì)胞貼壁，大部分為圓形，核漿清晰，基本上都為單核，位于細(xì)胞中央，折光率較大。72h 可以觀察到大部分呈梭形纖維狀，也有部分呈三角形和星形。有

2.3 實驗結(jié)果2.3.1 大鼠 MSCs 的分離培養(yǎng)離心后可以見到明顯的四層，，從上到下依次為：血小板層、白膜層、Percoll層、紅細(xì)胞及多核白細(xì)胞層，其中白膜層為單個核細(xì)胞層。小心吸取白膜層，離心洗滌，接種于 LG-DMEM 完全培養(yǎng)基中。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：剛接種的細(xì)胞呈圓形，個體較小，大小不均一，數(shù)量較多，處于懸浮狀態(tài)。24h 后可觀察到部分細(xì)胞貼壁，大部分為圓形，核漿清晰，基本上都為單核，位于細(xì)胞中央，折光率較大。72h 可以觀察到大部分呈梭形纖維狀，也有部分呈三角形和星形。有
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2573876