【摘要】： 目的：建立兔骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)的體外培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)體系。對BMSCs的抽取方式進(jìn)行改良，評價BMSCs體外傳代培養(yǎng)時不同培養(yǎng)基對BMSCs增殖能力的影響。比較自體BMSCs、成骨誘導(dǎo)后的BMSCs及二者聯(lián)合經(jīng)皮移植后體內(nèi)成骨能力的差異，評價其經(jīng)皮注射修復(fù)小段骨缺損的療效，為骨組織工程選擇種子細(xì)胞提供依據(jù)，為臨床上治療小段骨缺損以及骨不連提供一個新的思路。 方法：1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行BMSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。取第2代BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。定量測定培養(yǎng)液上清ALP活性，找出最強(qiáng)成骨活性的時間窗，并對成骨誘導(dǎo)前后的細(xì)胞增殖能力、成骨活性等生物學(xué)特性進(jìn)行比較。 2．隨機(jī)將16只日本大耳白兔32側(cè)髂部分為4組，前3組用骨穿針取骨髓，，第4組用普通一次性20毫升加藥注射器抽取骨髓，分別用α-MEM、DMEF-12、DMEM、DMEM行全骨髓培養(yǎng)法制備BMSCs。比較4組細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶所需天數(shù)及第2代BMSCs生長曲線。 3．制作新西蘭大白兔橈骨中段15mm骨缺損模型，20只兔共40側(cè)骨缺損模型隨機(jī)分為5組，每組8側(cè)。A組經(jīng)皮植入自體1×10~6個BMSCs和1×10~6個己向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs，B組植入2×10~6個已向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的BMSCs，C組植入2×10~6個BMSCs，D組植入纖維蛋白膠復(fù)合5mgBMP，E組為空白對照組。術(shù)后對動物進(jìn)行大體觀察、攝X線片觀察各組不同時相骨缺損修復(fù)情況，比較不同時相的骨缺損區(qū)X線阻射密度、并于術(shù)后第4，8，12周取出骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行大體觀察和組織學(xué)切片觀察；取第12周標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)檢測。 結(jié)果：1．骨髓穿刺針與普通一次性20毫升加藥注射器所取骨髓經(jīng)全骨髓培養(yǎng)法獲得的BMSCs的數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)、生長曲線沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 2．α-MEM培養(yǎng)基比DMEM、DMEF-12行全骨髓培養(yǎng)法制備BMSCs所需時間大大縮短，加入骨誘導(dǎo)成分后成骨誘導(dǎo)效率更高。 3．BMSCs與成骨誘導(dǎo)后的BMSCs聯(lián)合移植組在12周內(nèi)骨缺損區(qū)新生骨的數(shù)量和質(zhì)量顯著優(yōu)于單純移植BMSCs或單純移植成骨誘導(dǎo)后的BMSCs，空白組骨缺損主要由纖維結(jié)締組織填充。X線顯示術(shù)后4周即可發(fā)現(xiàn)4組動物的橈骨缺損區(qū)域均有明顯骨痂生成，第12周時A組即細(xì)胞聯(lián)合移植組的骨缺損完全愈合，各時相局部X線阻射密度值顯示，A、D組的新生骨痂最多，且可見髓腔再通現(xiàn)象；生物力學(xué)檢測顯示A組橈骨標(biāo)本的四點彎曲斷裂載荷均顯著高于其余2實驗組。 結(jié)論：普通一次性20毫升加藥注射器可代替骨穿針抽取兔髂嵴部位骨髓；α-MEM培養(yǎng)基比DMEM、DMEF-12更適合兔BMSCs的培養(yǎng)及成骨方向的誘導(dǎo)；.BMSCs與成骨誘導(dǎo)后的BMSCs聯(lián)合移植具有更強(qiáng)的成骨能力，可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程。
【圖文】：

3.6BMSCs脂肪方向誘導(dǎo)14天取出細(xì)胞爬片行油紅O染色，見多數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)有呈橙紅色的小圓形脂肪滴，部分細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴把胞核擠到了一側(cè)(見附圖1一Zd)。討論骨髓內(nèi)有兩種干細(xì)胞:造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。臨床上出于骨髓移植的需要，對造血干細(xì)胞的研究比較深入。造血干細(xì)胞能分化成全系列的血液細(xì)胞，但無法分化成結(jié)締組織的細(xì)胞。早在十九世紀(jì)六十年代就已發(fā)現(xiàn)骨髓的成骨特性。自20世紀(jì)70年代 Friedenstein等發(fā)現(xiàn)骨髓標(biāo)木中有少量貼附細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能分化形成類似骨、軟骨的集落后，對骨髓中這一小部分貼壁細(xì)胞的研究日漸深入。隨后的研究證實，骨髓成骨特性的基礎(chǔ)在于骨髓內(nèi)的這種成骨性前體細(xì)胞。大量文獻(xiàn)報道了從不同種屬如鼠、兔、犬、人

圖2一3不同培養(yǎng)條件下BMSCS的生長曲線3.3成骨誘導(dǎo)后的BMSCS培養(yǎng)上清液ALP的活性測定結(jié)果見表2一3，圖2一4。第3天時a一MEM組與另2處理組無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)，第6天Q一MEM組與DMEF一12組無統(tǒng)計學(xué)差異 (P>0.05)，但與DMEM組有差異(P<0.05)，從第9天起Q一MEM組與另3組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。3個處理組與未誘導(dǎo)對照組全程均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。表2一3成骨誘導(dǎo)后的BMSCS培養(yǎng)上清液ALP的活性測定Q一證M組D能F一12組DMEM組未誘導(dǎo)組第3天15士714士510士6第6天31士723士1221士10第9天49士835士932士511士5第12天62士1345士942士11第巧天53士1437士66士49士614士435士1117士7
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329;R687.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃廣林,王海,劉流,蔣協(xié)遠(yuǎn),張洪,田文,尹大慶;體外沖擊波治療骨不愈的臨床觀察[J];中華手外科雜志;2005年03期

本文編號：2572337