【摘要】： 目的 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae, S.pn)是肺炎,腦膜炎和中耳炎的主要病因,引起全世界范圍內(nèi)嬰幼兒,老年人和免疫缺陷個體疾病的主要病原菌。隨著耐藥菌株的不斷發(fā)現(xiàn),疫苗在其感染防治中的作用越來越重要。目前主要所用的是23價肺炎多糖疫苗和7價結(jié)合疫苗,但前者覆蓋的血清型有限而且不是T細(xì)胞依賴性的,對免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下小孩和老年人的保護(hù)性弱;后者存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換和載體攜帶的莢膜多糖血清型數(shù)量有限以及在肺炎高發(fā)人群中的保護(hù)作用小等問題,并且生產(chǎn)成本很高,不適合在發(fā)展中國家大量使用。因此發(fā)展肺炎鏈球菌蛋白疫苗迫在眉睫。 肺炎鏈球菌表面蛋白A( pneumococcal surface protein A,PspA)是S.pn主要的毒力因子之一,在肺炎鏈球菌侵襲性感染時起著重要的作用,它是最早作為S.pn蛋白質(zhì)疫苗的候選抗原之一;S.pn膽堿結(jié)合蛋白A(choline binding protein A,CbpA)作為S.pn的最為重要的表面蛋白成分之一,在S.pn引起腦膜炎時功能獨(dú)特,是最關(guān)鍵的毒力因子。而S.pn熱休克蛋白ClpP( caseinolytic protease )在S.pn從呼吸道(大約30到34℃)轉(zhuǎn)移到血液和(或)腦膜(37℃),幫助S.pn適應(yīng)宿主環(huán)境從而致病的過程中發(fā)揮著重要的功能。 因此,本研究擬對上述三種保護(hù)性抗原進(jìn)行克隆表達(dá),通過三種抗原間的不同組合方式來探索聯(lián)合多肽疫苗相對于單一多肽成分的優(yōu)勢性,并利用抗體被動保護(hù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證保護(hù)作用。 方法 1,用引物修飾法將S.pn基因組中擴(kuò)增PspA,CbpA和ClpP片段并構(gòu)建在原核表達(dá)載體PET-32a中。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對已公布的TIGR4型S.pn全基因組序列進(jìn)行相似性分析。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),鎳柱親和層析純化蛋白。應(yīng)用SDS-PAGE對表達(dá)和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析,透析除鹽,并用抗組氨酸單克隆抗體Western blot鑒定。純化的重組抗原分別免疫BALB/C小鼠,制備相應(yīng)多克隆抗體血清。 2,主動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),將96只BALB/C小鼠隨機(jī)分為8組(每組12只):對照組,PspA組, CbpA組, ClpP組, PspA+ CbpA混合組, PspA+ ClpP混合組, CbpA+ ClpP混合組, PspA+ CbpA+ ClpP混合組。分別于0.14.28天經(jīng)腹腔注射免疫,劑量為10 ug/只/次/種抗原。末次免疫后7天,每只小鼠經(jīng)眼眶取血,ELISA檢測免疫后血清特異IgG以證實(shí)高效價抗體的產(chǎn)生。7天后,每只小鼠經(jīng)腹腔感染TIGR4型肺炎鏈球菌,連續(xù)監(jiān)測21天小鼠的生存時間,計(jì)算各組的生存率。 3,抗體被動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),將96只BALB/C小鼠隨機(jī)分為8組(每組12只):對照組,Anti-PspA血清組, Anti-CbpA血清組, Anti-ClpP血清組, Anti-PspA + Anti-CbpA血清混合組,Anti-PspA+Anti-ClpP血清混合組, Anti-CbpA+Anti-ClpP血清混合組, Anti-PspA+ Anti-CbpA+ Anti-ClpP血清混合組。分別經(jīng)腹腔注射免疫,劑量為100 ul抗血清/只/種抗血清。免疫24小時后,每只小鼠經(jīng)腹腔感染TIGR4型肺炎鏈球菌,連續(xù)監(jiān)測21天小鼠的生存時間,計(jì)算各組的生存率。 結(jié)果 1,經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示,S.pn PspA基因片段被正確克隆到PET-32a原核表達(dá)載體中。PspA基因片段的核苷酸序列長度為1329bp,與GeneBank中序列比較,無堿基突變。重組工程菌IPTG誘導(dǎo),在BL21(DE3)菌中表達(dá)出了分子量約為66kD的Trx-PspA融合蛋白。重組蛋白以可溶形式表達(dá),表達(dá)量約占全菌蛋白的40%;經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度90%的重組蛋白。PspA重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。 2,經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建出原核表達(dá)載體pET32a(+)/CbpA。將重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后,IPTG誘導(dǎo),表達(dá)出了分子量約為80kD的Trx-CbpA融合蛋白。重組蛋白以可溶形式表達(dá),表達(dá)量約占全菌蛋白的20%;經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度90%的重組蛋白。CbpA重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。 3,重組工程菌pET32a(+)/ClpP經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)重組工程菌IPTG誘導(dǎo),在BL21(DE3)菌中表達(dá)出了分子量約為42kD的Trx-PspA融合蛋白。重組蛋白以包涵體形式表達(dá),表達(dá)量約占全菌蛋白的35%;經(jīng)Ni-NTA樹脂純化后得到了純度90%的重組蛋白。ClpP重組蛋白免疫BALB/C小鼠制備多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示抗體能夠與S.pn菌體蛋白起反應(yīng)。 4,重組蛋白的主動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),單一重組蛋白及混合組份經(jīng)腹腔免疫BALB/C小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體后,致死量的TIGR4腹腔感染。與對照組相比,抗原免疫組小鼠半數(shù)生存時間明顯延長(P0.05)。與其他抗原免疫組小鼠相比,三種亞單位重組蛋白免疫組半數(shù)生存時間最長(P0.05)。PspA免疫只能延長小鼠的生存時間而不能防止其死亡,三種亞單位重組蛋白免疫組保護(hù)率為100%,與其他組小鼠(ClpP和PspA混合免疫組除外)相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5,抗體的被動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),與對照組相比,抗體免疫組小鼠生存時間明顯延長(P0.001)。三種抗體(Anti-PspA+Anti-CbpA+Anti-ClpP)混合免疫組與單一抗體免疫組相比,半數(shù)生存時間明顯延長(P0.025)。PspA多克隆抗體血清同樣只能延長小鼠生存時間而不能防止其死亡。與單一抗體免疫組小鼠相比,三種抗體混合免疫組保護(hù)效率最高(P0.05)。 結(jié)論 1,成功構(gòu)建了pET32a(+)/PspA, pET32a(+)/CbpA, pET32a(+)/ClpP原核表達(dá)載體。純化的重組蛋白PspA,CbpA和ClpP,具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性,可以作為S.pn基因工程疫苗的候選抗原。 2,成功制備了重組蛋白PspA,CbpA和ClpP的多克隆抗血清,它們都能和肺炎鏈球菌菌體蛋白發(fā)生特異性的反應(yīng)。 3,亞單位疫苗主動免疫動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示它們能夠保護(hù)BALB/C小鼠抵抗致死量TIGR4型S.pn的攻擊,其中三種疫苗蛋白混合免疫能夠產(chǎn)生很好的保護(hù)效果,為進(jìn)一步的S.pn多肽聯(lián)合疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 4,抗血清的被動免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白的多克窿抗體能夠能夠保護(hù)BALB/C小鼠抵抗致死量TIGR4型S.pn的攻擊,其中三種抗體聯(lián)合免疫能夠得到最佳的保護(hù)效果,進(jìn)一步證實(shí)主動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)所取得的結(jié)果。
【圖文】：

l 作為調(diào)零用；取純化產(chǎn)物 20μl，也以 0.15mmol/L Nacl 補(bǔ)足至總體積 200μl；每管加入考馬斯亮藍(lán) G-250 染液 2ml，，振蕩混勻后室溫靜置 30min；于 DU -Series600 全波長分光光度計(jì)中讀取 A590 值，由儀器自動繪制標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算樣品蛋白含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 PspA,CbpA 和 ClpP 基因的 PCR 擴(kuò)增以 TIGR4S.pn 基因組 DNA 為模板,為引物，擴(kuò)增 PspA,CbpA 和 ClpP，獲得段，PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖 2，3，4。M 1 2 3 41 2 MM 1

圖 5 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of therecombinant PET32a/PspALane1－2: PET32a/PspAdigested by EcoRI and KpnI;Lane3－4: PET32a/PspA;M: DNA Marker;圖 6 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定Fig.2 Identification ofthe recombinant PET32a/ClpPLane 1: PET32a digestedby EcoRI and SacI; Lane 2:PET32a/ClpP digested byEcoRI and SacI; M: DNAMarker; Lane 3: PET32a/clpP;Lane 4: PET32a圖 7 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定Fig.2 Identification ofrecombinant PET32a/CbpAM:DNA marker; Lane 1:PET32a/CbpA digested byEcoRI and BamHI;Lane 2: PET32a/CbpA;（一） 重組質(zhì)粒 A 雙向測序結(jié)果重組質(zhì)粒 pET32a(+)/PspA, pET32a(+)/CbpA 和 pET32a(+)/ClpP 測序結(jié)果與GenBank 報道序列完全一致。CbpA:CCAGATCTGGGTACCATGATTTTAACAAGTCTAGCCAGCGTCGCTATCTT
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2571954