【摘要】： 人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ，hFⅦ)是一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，由肝臟合成，在凝血過程中發(fā)揮著極其重要的作用，是凝血塊形成起始的關鍵分子之一。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅶ不僅適用于先天性和獲得性FⅦ缺乏癥的病人，而且還適用于治療存在FⅦ和FⅨ抑制物的血友病病人，以及血小板減少癥和血小板功能障礙病人的出血、止血和出血預防等；由于FⅦ能夠結(jié)合暴露的組織因子(tissue factor,TF)而啟動外源性凝血途徑，使其在戰(zhàn)傷止血、嚴重創(chuàng)傷、無法控制的大面積外科手術(shù)的止血等方面具有獨特的作用。 血漿中FⅦ的含量非常低，大約為200～400ng/ml，屬血漿微量蛋白，難以規(guī)模化制備，而基因重組技術(shù)的發(fā)展為許多天然微量蛋白的規(guī)模化制備提供了可能。本研究就人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中的表達與純化情況進行了探索。 本研究主要包括以下幾部分： 1．人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆及其在哺乳動物細胞中的表達 為了實現(xiàn)重組人凝血因子Ⅶ(recombinant human coagulation factorⅦ，rhFⅦ)在哺乳動物細胞中的表達，我們針對人凝血因子Ⅶ(human coagulation factorⅦ，hFⅦ)cDNA序列設計引物，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應從人胎肝總RNA中釣取人凝血因子ⅦcDNA，將其克隆入pGEM-T載體中，通過酶切、PCR鑒定及序列測定，結(jié)果表明我們獲得了全長為1335bp的hFⅦcDNA基因。 將測序正確的hFⅦcDNA基因亞克隆進真核表達載體pcDNA5/FRT/TO中，經(jīng)過PCR和BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，并將鑒定正確的載體命名為pTO-FⅦ。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將所構(gòu)建的真核表達載體pTO-FⅦ和輔助質(zhì)粒pOG44共轉(zhuǎn)染Flp-In 293TR細胞系，通過75μg/mL的Hygromycin B壓力篩選，獲得抗性細胞；挑取抗性細胞的集落，通過有限稀釋法進行細胞的克隆，獲得了10株克隆細胞株；分別提取細胞的基因組DNA，應用PCR檢測目的基因的整合情況；對于PCR檢測陽性的細胞克隆，用含有四環(huán)素的表達培養(yǎng)基進行誘導表達，分別收集不同細胞克隆的表達上清進行SDS-PAGE及Western Blot檢測，結(jié)果表明表達產(chǎn)物中有凝血因子Ⅶ的存在；用凝血因子Ⅶ促凝活性檢測試劑盒進行活性測定，結(jié)果表明表達產(chǎn)物具有明顯的促凝活性。說明成功實現(xiàn)了重組人凝血因子Ⅶ在哺乳動物細胞中的表達。 2．抗人凝血因子Ⅶ單克隆抗體的制備及鑒定 應用雜交瘤融合技術(shù)，以重組人凝血因子Ⅶ為抗原免疫Bal b/c小鼠。取免疫小鼠的脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)過間接ELISA法篩選、融合細胞有限稀釋法克隆等方法篩選出3株單克隆抗體雜交瘤細胞株，分別是3E8、3D2、1C5，誘生的腹水效價分別為1：1×10~7、1：1×10~6、1：1×10~6。 用ELISA的方法分別對克隆化雜交瘤細胞株的亞類進行了鑒定，3株單克隆細胞株(3E8、3D2、1C5)的亞類分別是IgG2a、IgG1、IgG1；對單抗的特異性鑒定結(jié)果顯示所制備的單抗與多種血漿蛋白均無交叉反應，表明單抗是特異的。 然后用3B8雜交瘤細胞株誘生小鼠腹水，應用蛋白A親和層析的方法進行單抗的純化，經(jīng)過蛋白A親和層析，我們獲得了純化的單抗。 人凝血因子Ⅶ單克隆抗體的成功制備與純化，為建立人凝血因子Ⅶ檢測及純化方法奠定了基礎。 3．應用單克隆抗體親和層析法純化重組凝血因子Ⅶ 將制備并純化的388單抗與CNBr-Sepharose 6B Fast Flow進行偶聯(lián)，制備單克隆抗體偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)McAb-Sepharose 6B FF，為了對制備的McAb-Sepharose 6B FF進行親和層析驗證，我們用重組凝血因子Ⅶ標準品進行了層析試驗和條件的優(yōu)化，結(jié)果表明我們所制備的層析柱能夠特異性地結(jié)合重組凝血因子Ⅶ標準品；對層析條件進行優(yōu)化，表明用20mmol/L的PBS作為結(jié)合緩沖液，含1mol/L NaCl的PBS作為洗脫緩沖液具有較好的層析效果。 在層析柱驗證的基礎上，我們開展了細胞表達重組凝血因子Ⅶ的純化試驗，首先將細胞表達上清用DEAE-Sephadex A-50進行吸附，吸附產(chǎn)物用Sephadex G-25脫鹽柱進行脫鹽處理并更換為結(jié)合緩沖液；然后將脫鹽處理的表達產(chǎn)物用McAB-Sepharose 6B Fast Flow進行親和層析，結(jié)果顯示在用洗脫緩沖液洗脫時獲得了單一的洗脫蛋白峰。 進而對洗脫蛋白峰進行SDS-PAGE、Western Blotting、促凝活性測定及肽質(zhì)量指紋譜分析，結(jié)果顯示純化蛋白的相對分子量約為50kDa，與標準品分子量基本一致，進一步的驗證結(jié)果表明，獲得了純化的重組凝血因子Ⅶ。 本研究在成功克隆中國人凝血因子Ⅶ的基礎上實現(xiàn)了其在哺乳動物細胞中的可誘導表達，，通過單克隆抗體的制備，建立了單克隆抗體親和層析純化rhFⅦ的簡便方法。為今后rhFⅦ的研制奠定了堅實的基礎。
【圖文】：

圖2.重組質(zhì)粒pT-FVll的雙酶切和PCR鑒定結(jié)果a.oLZooom叭e;b.PT-FVll雙酶切結(jié)果e.PT-FVllPCR鑒定分析隆質(zhì)粒經(jīng)全自動測序儀測序分析表明，所克隆的子VllcDNA基因序列基本一致，由1335bP組成位、738位、1011位堿基與發(fā)表的序列不同(有變化。:CCTCAGGCCCACAGAGGGGAAGCTTGCAAGAC從弘CACCAAGCTCCTCTGCCTTCTGCTrGGGCGTCCTGCACC弱CGCCGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCGTTCTGGATTTC竹ACAGTGGACCAGCTCCAGTCCTATATATGACCAGCTGATCTGTGTGGCGCTCCTGTCGGTGCCACGGCGCGCC從CTCCTTCGAGGAT園歐AccACTGCTTCTGC從CGAGAACGAGG弘TACTCCTGCCTGGGCG竹CCAGGCCCGGTGTGCCCTCCCTGGCGGCI、GTTCTGCTGG

將pT一FVll克隆質(zhì)粒經(jīng)全自動測序儀測序分析表明，所克隆的目的基因序列與己發(fā)表的人凝血因子 VllcDNA基因序列基本一致，由1335bP組成。該cDNA基因的第255位、558位、738位、1011位堿基與發(fā)表的序列不同(圖3、4)，但所編碼的氨基酸序列沒有變化。測序結(jié)果如下: ATGGTCTCCCAGGCCCTCAG TAACCCAGGAGGAAGCCCAC GCCGGGCTCCCTGGAGAGGG GACGCGGA(3AGGACGAAGCT AGAATGGGGGCTCCTGCAAGG從 CTGTGAGACGCAC從弘 AGTGACCACACGGGCACCAA CCTGCACACCCACAGTTGAACCAAGGCC(子 AATTGTGGGGG AATGGAGCTCAGTTGTGTGGACAAAATCAATGAGCAGA(二CATCGCGCTGCGGACGTTCTCCCGTGGCGCCeAGTe棲巫GCAAGGACTCGAACTGGAGGCGGCGGGTGGTCCGCCTGCATGAGAGGACGACGGCCCTGGAGGTGGGAGACTGCAAGGGG GCTCCTCTGCCTTCTGCTrG GGCGTCCTGCACC弱CGCCG AGTGCAAGGAGGAGCAGTGC GTTCTGGATTTC竹ACAGTG
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【引證文獻】

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1 劉鎣燦;人EEF1A1-人凝血因子雜合基因座的構(gòu)建及其在293FT細胞中表達的鑒定[D];陜西師范大學;2012年

本文編號：2571943