【摘要】：目的:構(gòu)建陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹的人促甲狀腺激素受體胞外段基因真核表達(dá)質(zhì)粒。方法:PCR擴(kuò)增穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHR289目的基因并連接于真核表達(dá)質(zhì)粒pcD NA3.1+上,重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及測(cè)序法鑒定。陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289。結(jié)果:重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示出現(xiàn)512bp條帶。正向測(cè)序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)锳AT,為同義突變。反向測(cè)序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT,亦為同義突變。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與重組質(zhì)粒的體積質(zhì)量比例為3∶1。結(jié)論:酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289構(gòu)建成功。
【圖文】：

粒pcDNA3．1+KpnI和XbalI雙酶切產(chǎn)物鑒定兩種質(zhì)粒雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖1)，穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后的條帶大小為867bp，真核質(zhì)粒pcDNA3．1+雙酶切后條帶大小為4459bp。2．2重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289用HindⅢ酶切后產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖2)，出現(xiàn)512bp小條帶。2．3重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289公司測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行正向和反向測(cè)序，吻合度均達(dá)到99%。正向測(cè)序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)閳D1pcDNA3．1+和PNMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后0．8%凝膠電泳圖注:Maker為L(zhǎng)ambda，DNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖2連接產(chǎn)物HindⅢ酶切后重組質(zhì)粒出現(xiàn)512bp小條帶注:Maker為L(zhǎng)ambdaDNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖3陽(yáng)離子脂質(zhì)體(箭頭)。AAT，為同義突變。反向測(cè)序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT，，亦為同義突變。2．4陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289制作出的DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體用ZETASIZEＲ激光粒徑分析儀(英國(guó)MalvernInstruments公司)測(cè)得粒徑平均值為92．3nm，測(cè)得最高峰值為126．0nm(圖3)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的體積質(zhì)量比例為3∶1。2152國(guó)際眼科雜志2014年12月第14卷第12期www．ies．net．cn電話:029-8224517282210956電子信箱:IJO．2000@163．com

in，即得DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體(5mg/mL)。pcDNA3．1+/TSHＲ289重組質(zhì)粒與DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體按照質(zhì)量體積比1∶3混合。2結(jié)果2．1穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物和真核質(zhì)粒pcDNA3．1+KpnI和XbalI雙酶切產(chǎn)物鑒定兩種質(zhì)粒雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖1)，穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后的條帶大小為867bp，真核質(zhì)粒pcDNA3．1+雙酶切后條帶大小為4459bp。2．2重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289用HindⅢ酶切后產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖2)，出現(xiàn)512bp小條帶。2．3重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289公司測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行正向和反向測(cè)序，吻合度均達(dá)到99%。正向測(cè)序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)閳D1pcDNA3．1+和PNMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后0．8%凝膠電泳圖注:Maker為L(zhǎng)ambda，DNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖2連接產(chǎn)物HindⅢ酶切后重組質(zhì)粒出現(xiàn)512bp小條帶注:Maker為L(zhǎng)ambdaDNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖3陽(yáng)離子脂質(zhì)體(箭頭)。AAT，為同義突變。反向測(cè)序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT，亦為同義突變。2．4陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289制作出的DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體用ZETASIZEＲ激光粒徑分析儀(英國(guó)MalvernInstruments公司)測(cè)得粒徑平均值為92．3nm，測(cè)得最高峰值為126．0nm(圖3)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的體積質(zhì)量比例為3∶1。2152國(guó)際眼科雜志2014年12月第14卷第12期www．ies．net．cn電話:029-8224517282210956電子信箱:IJO．2000@163．com

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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3 陳

本文編號(hào)：2570935