【摘要】：目的:構建陽離子脂質(zhì)體包裹的人促甲狀腺激素受體胞外段基因真核表達質(zhì)粒。方法:PCR擴增穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHR289目的基因并連接于真核表達質(zhì)粒pcD NA3.1+上,重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及測序法鑒定。陽離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289。結果:重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出現(xiàn)512bp條帶。正向測序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)锳AT,為同義突變。反向測序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT,亦為同義突變。陽離子脂質(zhì)體與重組質(zhì)粒的體積質(zhì)量比例為3∶1。結論:酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒pcD NA3.1+/TSHR289構建成功。
【圖文】：

粒pcDNA3．1+KpnI和XbalI雙酶切產(chǎn)物鑒定兩種質(zhì)粒雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖1)，穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后的條帶大小為867bp，真核質(zhì)粒pcDNA3．1+雙酶切后條帶大小為4459bp。2．2重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289用HindⅢ酶切后產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖2)，出現(xiàn)512bp小條帶。2．3重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289公司測序鑒定重組質(zhì)粒送至上海英俊生物技術有限公司進行正向和反向測序，吻合度均達到99%。正向測序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)閳D1pcDNA3．1+和PNMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后0．8%凝膠電泳圖注:Maker為Lambda，DNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖2連接產(chǎn)物HindⅢ酶切后重組質(zhì)粒出現(xiàn)512bp小條帶注:Maker為LambdaDNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖3陽離子脂質(zhì)體(箭頭)。AAT，為同義突變。反向測序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT，，亦為同義突變。2．4陽離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289制作出的DOTAP/Chol陽離子脂質(zhì)體用ZETASIZEＲ激光粒徑分析儀(英國MalvernInstruments公司)測得粒徑平均值為92．3nm，測得最高峰值為126．0nm(圖3)。陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的體積質(zhì)量比例為3∶1。2152國際眼科雜志2014年12月第14卷第12期www．ies．net．cn電話:029-8224517282210956電子信箱:IJO．2000@163．com

in，即得DOTAP/Chol陽離子脂質(zhì)體(5mg/mL)。pcDNA3．1+/TSHＲ289重組質(zhì)粒與DOTAP/Chol陽離子脂質(zhì)體按照質(zhì)量體積比1∶3混合。2結果2．1穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物和真核質(zhì)粒pcDNA3．1+KpnI和XbalI雙酶切產(chǎn)物鑒定兩種質(zhì)粒雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖1)，穿梭質(zhì)粒PHMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后的條帶大小為867bp，真核質(zhì)粒pcDNA3．1+雙酶切后條帶大小為4459bp。2．2重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289用HindⅢ酶切后產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖2)，出現(xiàn)512bp小條帶。2．3重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289公司測序鑒定重組質(zhì)粒送至上海英俊生物技術有限公司進行正向和反向測序，吻合度均達到99%。正向測序發(fā)現(xiàn)AAC突變?yōu)閳D1pcDNA3．1+和PNMCMVTSHＲ289PCＲ產(chǎn)物雙酶切后0．8%凝膠電泳圖注:Maker為Lambda，DNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖2連接產(chǎn)物HindⅢ酶切后重組質(zhì)粒出現(xiàn)512bp小條帶注:Maker為LambdaDNA/EcoＲI+HindⅢMarker，3。圖3陽離子脂質(zhì)體(箭頭)。AAT，為同義突變。反向測序發(fā)現(xiàn)GCG突變?yōu)镚CT，亦為同義突變。2．4陽離子脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA3．1+/TSHＲ289制作出的DOTAP/Chol陽離子脂質(zhì)體用ZETASIZEＲ激光粒徑分析儀(英國MalvernInstruments公司)測得粒徑平均值為92．3nm，測得最高峰值為126．0nm(圖3)。陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的體積質(zhì)量比例為3∶1。2152國際眼科雜志2014年12月第14卷第12期www．ies．net．cn電話:029-8224517282210956電子信箱:IJO．2000@163．com

【參考文獻】

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1 張志人;安鐵洙;王子竹;樸善花;王春生;;小鼠miR367逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構建與檢測[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年05期

2 劉雪萍;賀斌峰;陳華萍;孫歡;楊俊俊;魏征華;竇寅;王關嵩;;新型納米載體Ac-αCD攜帶的Bcl-xl反義寡核苷酸對肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2013年09期

3 王利偉;李文建;鄭穎;仝宇紅;趙曉東;趙嵐;錢雪松;閆金成;;細胞因子IL-23p19不同長度3'UTR質(zhì)粒的構建[J];河北醫(yī)藥;2013年09期

4 李勁松,葉展,趙涵芳,陳詩書;陽離子脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染真核細胞的研究[J];上海第二醫(yī)科大學學報;2005年10期

5 周菁;張峰;龐海林;馬麗;劉佳鈺;劉理禮;張賀龍;;慢病毒載體介導的RNA干擾下調(diào)膜聯(lián)蛋白A1對小細胞肺癌細胞生物學行為的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2013年05期

6 任先越;楊立群;梁玄;劉珍珍;鄧宇斌;;陽離子聚合物在非病毒基因轉(zhuǎn)染中的研究進展[J];生物工程學報;2013年05期

7 王順娟;夏海濱;;雙表達人Arid5a及報告基因eGFP的重組腺病毒載體的構建及鑒定[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2013年05期

8 張新秀;何守志;郭維維;翟所強;;PEDF-GFP基因轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜的實驗研究[J];眼科新進展;2006年04期

9 毛曉春;張虹;李貴剛;;脂質(zhì)體介導兔角膜內(nèi)皮細胞基因轉(zhuǎn)染的觀察[J];眼科新進展;2007年07期

10 宗莉;陳伶俐;張淑蕓;楊曉容;朱家壁;;殼聚糖納米粒作為基因載體的研究:制備,特征和對DNA的保護[J];中國藥科大學學報;2005年06期

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 趙微;李久純;巴彩鳳;蘇榮健;蘇玉虹;;豬CFL2b/熒光蛋白融合基因在小鼠成肌細胞中的表達與定位[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2008年35期

2 左玲;欒永昕;姜揚;裴穎;蘇冠方;;脂質(zhì)體介導質(zhì)粒pcDNA3.1/KDRn3基因在轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達及定位[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2010年03期

3 潘敏慧;劉敏;劉佳;杜娟;張春東;魯成;;陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞的技術體系研究[J];蠶業(yè)科學;2008年04期

4 田中偉,宋向鳳,彭振輝;FHIT基因真核細胞表達載體的構建與鑒定[J];第三軍醫(yī)大學學報;2004年02期

5 屈超義;唐羅生;曾杰西;陳百華;羅靜;魏為;王文軍;;CD105特異性shRNA表達質(zhì)粒的構建和篩選[J];國際眼科雜志;2008年06期

6 范江;海俐;唐磊;吳勇;;己二醇橋聯(lián)膽甾半乳糖苷的合成[J];華西藥學雜志;2006年05期

7 程黎娜;甘華田;;RNA干擾技術及其在醫(yī)學研究中的應用[J];華西醫(yī)學;2008年03期

8 鄭萍;;三甲基殼聚糖納米顆粒體外轉(zhuǎn)染pEGFP蛋白質(zhì)粒的實驗研究[J];華中醫(yī)學雜志;2007年06期

9 ;Enhancement of transfection efficiency for HeLa cells via incorporating arginine moiety into chitosan[J];Chinese Science Bulletin;2007年23期

10 李紅宇;高松;王瑩;袁文;張競;呂碧濤;徐盛明;;陽離子脂質(zhì)體介導的重組pEGFP-N1-IGF-1質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染在損傷后脊髓組織內(nèi)的表達[J];脊柱外科雜志;2006年04期

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1 宗莉;張淑蕓;袁喜英;楊曉容;;殼聚糖介導的基因轉(zhuǎn)染研究[A];2006第六屆中國藥學會學術年會論文集[C];2006年

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1 王小梅;肝素化殼聚糖/大豆蛋白質(zhì)復合材料的制備及其抗凝血功能研究[D];武漢大學;2011年

2 元東;p73基因?qū)θ祟惙蜗侔┭苌捎绊懙膶嶒炑芯縖D];第三軍醫(yī)大學;2004年

3 孫遜;靜脈注射用治療基因靶向傳遞系統(tǒng)的研究[D];四川大學;2005年

4 魏梅洋;脂質(zhì)體介導膠質(zhì)細胞生長因子基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對大鼠脊髓損傷修復作用的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

5 薛亞軍;膠質(zhì)細胞生長因子-2在顱腦損傷中作用的研究及其基因重組蛋白制備[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

6 付蔚華;FasL質(zhì)粒載體構建及在小鼠心臟移植中抗排斥反應的研究[D];天津醫(yī)科大學;2006年

7 李紅宇;陽離子脂質(zhì)體介導胰島素樣生長因子-1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療脊髓壓迫性損傷的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

8 向健威;BTBD-10基因在人腦膠質(zhì)瘤細胞中功能的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

9 蘇偉;光響應聚合物囊泡的制備與性質(zhì)研究[D];中國科學技術大學;2007年

10 劉剛;RNA干擾CⅡTA控制大鼠肝移植急性排斥反應的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 何多姣;不可分型流感嗜血桿菌外膜蛋白P6基因真核表達質(zhì)粒的構建及其免疫原性分析[D];河北北方學院;2011年

2 駱曉練;siRNA治療大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

3 陳

本文編號：2570935