【摘要】： 目的 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗;分析重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)效率;通過(guò)不同途徑接種疫苗,在MTB攻擊后,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清抗體及其亞類變化脾T淋巴細(xì)胞增殖脾T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群變化以及脾細(xì)胞凋亡情況,從而初步闡述其保護(hù)性免疫機(jī)制,為結(jié)核病的防治提供一種有價(jià)值的疫苗。 方法 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得ESAT-6和MPT64抗原編碼基因序列,然后采用序貫PCR(gene SOEing)法將ESAT-6和MPT64編碼基因用疏水甘氨酸接頭(Gly4Ser)3經(jīng)PCR擴(kuò)增融合,定向克隆入大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64;用電穿孔法將該質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 ( DE3 )及Bb ,構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌重組Bb-ESAT-6-MPT64疫苗。 SDS-PAGE及Western blot分析pGEX-ESAT-6-MPT64在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1～13h表達(dá)的目的蛋白。 為了研究rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后,抗MTB攻擊產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及其保護(hù)性免疫機(jī)制,將65只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,每組13只。A組: rBb-ESAT-6-MPT64皮下注射;B組:rBb-ESAT-6-MPT64肌肉注射;C組:rBb-ESAT-6-MPT64鼻腔粘膜接種;D組:Bb皮下注射對(duì)照;E組:100μl PBS皮下注射對(duì)照。A、B組:5×106CFU疫苗懸浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下單次注射及肌肉注射;C組:5×105CFU疫苗懸浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜單次接種;D組:5×106CFU Bb懸浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下單次注射。5組均于疫苗免疫8w后用5×105CFU MTB鼻腔內(nèi)攻擊。在MTB攻擊感染后6w,用ELISA方法檢測(cè)各組鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE抗體水平;用MTT比色法檢測(cè)脾細(xì)胞增殖水平;用FCM檢測(cè)脾細(xì)胞CD4+和CD8+亞群變化及用Annexin V-FITC試劑盒檢測(cè)脾細(xì)胞原液或ConA刺激培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞凋亡發(fā)生率。 結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)PCR擴(kuò)增的ESAT-6-MPT64融合基因全長(zhǎng)1020bp,序列分析發(fā)現(xiàn)其與預(yù)期結(jié)果一致;雙酶切證實(shí)ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中,成功構(gòu)建能夠表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64;將含50μg/ml Amp的MRS瓊脂平板篩選的rBb經(jīng)PCR鑒定分析,證實(shí)pGEX-ESAT-6-MPT64成功轉(zhuǎn)進(jìn)Bb,rBb-ESAT-6-MPT64疫苗構(gòu)建成功。 SDS-PAGE及Western blot分析重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1～13h表達(dá)了60kDa的目的蛋白,占菌體總蛋白的22%,且能與人血清抗體發(fā)生特異結(jié)合。 疫苗免疫8W后用5×105CFU MTB H37Ra減毒株鼻腔內(nèi)進(jìn)行攻擊,在H37Ra攻擊感染后6w用ELISA法檢測(cè)抗體結(jié)果:A～C組中,小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均較對(duì)照組D、E組顯著增高,IgG3和IgE水平均較對(duì)照組D、E組無(wú)顯著差異;3組之間的相互比較:C組IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b水平較A、B組顯著增高,C組IgG3和IgE水平均較A、B組無(wú)顯著差異,A、B組之間各抗體水平無(wú)顯著差異。 用MTT法檢測(cè)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果: A～C組中,小鼠脾細(xì)胞原液組、MTB刺激組或ConA刺激培養(yǎng)組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均顯著高于D、E對(duì)照組,每個(gè)ConA刺激組增殖指數(shù)顯著高于相應(yīng)的原液組或MTB刺激組;每個(gè)MTB刺激組增殖指數(shù)顯著高于相應(yīng)的原液組;在原液組中,三組之間均無(wú)顯著性差異;在MTB刺激組中,C組鼻腔粘膜接種組增殖指數(shù)顯著高于B組肌肉注射組,余無(wú)顯著性差異;在ConA刺激組中,C組鼻腔粘膜接種組增殖指數(shù)顯著高于A組皮下注射組和B組肌肉注射組,A、B組之間無(wú)顯著性差異。 用FCM檢測(cè)CD4+和CD8+亞群水平結(jié)果:A～C組CD8+亞群水平均較D、E對(duì)照組增加,但均無(wú)顯著差異;A～C組CD4+亞群水平分別較D、E對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義增加;各組之間兩兩比較,C組CD4+亞群水平較A、B組有顯著性增加,余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 用Annexin V-FITC試劑盒檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞凋亡結(jié)果:A～C組中,小鼠脾細(xì)胞原液組或ConA刺激培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡發(fā)生率均顯著低于D、E對(duì)照組,每個(gè)ConA刺激組脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著高于相應(yīng)的原液組;C組鼻腔粘膜接種組脾細(xì)胞凋亡率顯著低于A組皮下注射組和B組肌肉注射組;A組皮下注射組脾細(xì)胞凋亡率顯著低于B組肌肉注射組。 結(jié)論 1.通過(guò)序貫PCR成功擴(kuò)增出ESAT-6-MPT64融合基因。 2.成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-ESAT-6-MPT64。 3.成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗。 4.結(jié)核分枝桿菌重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64能在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)效率為22%,并且表達(dá)的重組蛋白具有特異的抗原性。 5.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性CD4+Th1型細(xì)胞免疫、體液免疫及微弱的CD8+CTL反應(yīng)。 6.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗鼻腔粘膜接種途徑誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生的保護(hù)性優(yōu)于皮下注射和肌肉注射途徑。
【圖文】：

e 1-2: ESAT-6-MPT64 PCR productLane 3: DNA MarkerIdentification of PCR product of ES-3 ESAT-6-MPT64 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒很多如陰離子去污劑法、苯酚抽近年來(lái)已逐漸被試劑盒所取代。有一層惰性大分子材料，能選擇核酸類物質(zhì)。作者在制備基因組Protein K 和去污劑裂解細(xì)菌釋放簡(jiǎn)單的步驟即可除去非特異性結(jié)的 DNA。此法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 汪圣強(qiáng);王柯;裴豪;;主動(dòng)外排系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌耐藥[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)工程;2011年07期

2 王海全;;64例塵肺結(jié)核痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)藥敏結(jié)果分析[J];中國(guó)醫(yī)藥指南;2011年21期

3 董海燕;張建中;萬(wàn)康林;;結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)因子研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年06期

4 黃志強(qiáng);張日東;吳智龍;陳世浩;;新型改良羅氏培養(yǎng)基與羅氏酸基檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌比較[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年09期

5 呂中全;張明新;張慧;;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的價(jià)值[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

6 陳士東;;296例結(jié)核性腦膜炎臨床分析[J];醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐;2011年13期

7 金法祥;王華鈞;孫小軍;;DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的研究[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年12期

8 廖傳玉;黃正谷;陳天剛;李同心;萬(wàn)東勇;饒霞;徐艷;侯毅;鐘敏;嚴(yán)嘵峰;;2004～2009年我中心結(jié)核分枝桿菌臨床株耐藥趨勢(shì)[J];臨床肺科雜志;2011年08期

9 張偉錚;黃彬;林冬玲;鄂順梅;薛新娜;曾建明;陳茶;;結(jié)核分枝桿菌自身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2011年06期

10 王瑞博;井申榮;;結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白TB10.4的功能和應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2011年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 戴廣明;曹以誠(chéng);杜正平;陳洵;黃曙海;逄宇;周楊;黃海榮;趙雁林;;結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)快速檢測(cè)方法的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2010年

2 許優(yōu);孫惠平;張?jiān)鲑t;劉莉娜;;關(guān)于結(jié)核分枝桿菌定量方法的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 劉毅;李衛(wèi)民;田苗;孫照剛;李傳友;周輝;張治國(guó);高鐵杰;高峰;;快速篩選定義北京基因型結(jié)核分枝桿菌的新方法[A];2007年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

4 張?jiān)滦?辛毅;馬郁芳;;結(jié)核分枝桿菌RmlB的表達(dá)、純化及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[A];2008年全國(guó)糖生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2008年

5 劉焰;劉勝武;談蓉;馬立新;劉君炎;;結(jié)核分枝桿菌Ag85B與ESAT-6雙順?lè)醋又亟M腺表達(dá)載體的構(gòu)建[A];第六屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

6 吳園;鐘敏;王易偉;鐘靜;胡頻頻;毛旭虎;;Rv0341用于診斷依賴?yán)Ｆ浇Y(jié)核分枝桿菌結(jié)核病的研究概況[A];中國(guó)防癆協(xié)會(huì)臨床委員會(huì)、中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)委員會(huì)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

7 張旭霞;張海青;李傳友;田苗;趙冰;李衛(wèi)民;張健源;印云青;焦揚(yáng);端木宏謹(jǐn);;結(jié)核分枝桿菌黏附素HBHA防治結(jié)核病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[A];2005年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

8 陳曦;張宗德;劉忠泉;賈紅彥;邢愛(ài)英;古書香;;結(jié)核分枝桿菌rv3873、rv3879c基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2006年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

9 周慶;方中飛;沈小英;宋冰;方孝美;;臨床分離結(jié)核分枝桿菌的耐藥性分析[A];2006年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2006年

10 陳濤;周琳;周杰;江勇;周志剛;彭建明;文力;彭東東;何超文;鐘球;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法建立與臨床應(yīng)用評(píng)估[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)2011年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 韓曉玲　通訊員 范敬群 金安江;華中農(nóng)大研究成果獲世界聲譽(yù)[N];湖北日?qǐng)?bào);2009年

2 莊愉;新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

3 記者 陳青;讓結(jié)核菌三天內(nèi)原形畢露[N];文匯報(bào);2009年

4 錢忠軍;華中農(nóng)大發(fā)現(xiàn)新基因有望控制結(jié)核病[N];江蘇科技報(bào);2009年

5 駐鄂記者 錢忠軍　通訊員 金安江 范敬群;發(fā)現(xiàn)可能控制結(jié)核病的新基因[N];文匯報(bào);2009年

6 記者 黃每裕;珠海推出兩種檢測(cè)試劑新產(chǎn)品[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

7 莊愉;新型抗結(jié)核疫苗的開發(fā)研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

8 記者 項(xiàng)錚;團(tuán)山會(huì)議研討罕見(jiàn)病原體防治策略[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

9 ;整合力量 抗擊“瘟神”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

10 宋心德;ＩＤＳＡ２基因?qū)е陆Y(jié)核桿菌產(chǎn)生抗藥性[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 董海燕;中國(guó)13省市結(jié)核分枝桿菌基因多態(tài)性分析[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2011年

2 陳嘉臻;結(jié)核分枝桿菌特異的RD2/RD11蛋白應(yīng)用于結(jié)核免疫診斷的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 王平;肺分枝桿菌感染臨床特征、耐藥模式、預(yù)后研究及肺組織結(jié)核分枝桿菌巢式PCR檢測(cè)[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

4 陳軍;武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性及氟喹諾酮耐藥分子機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2011年

5 陳軍;武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性及氟喹諾酮耐藥分子機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2011年

6 樂(lè)軍;耐藥結(jié)核分枝桿菌的多維分析[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

7 孫勇;北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥分子特點(diǎn)及結(jié)核分枝桿菌耐喹諾酮類藥物泵機(jī)制的初步研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2012年

8 劉凱;結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者和初發(fā)結(jié)核病患者免疫分子標(biāo)識(shí)的篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

9 宋文剛;茜草素抗結(jié)核分枝桿菌作用機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2007年

10 姜曉穎;北京地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 曾莉蓉;結(jié)核分枝桿菌重組Bb-ESAT-6-MPT64疫苗構(gòu)建及其免疫機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

2 謝婷;結(jié)核分枝桿菌重組Bb-ESAT-6-MPT64疫苗保護(hù)力及其免疫機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

3 蔡溢;結(jié)核分枝桿菌RmlA的表達(dá)、純化以及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2006年

4 王霞芳;IFN-γ增強(qiáng)BALB/c小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗力[D];蘇州大學(xué);2002年

5 曹立雪;應(yīng)用膜芯片檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

6 韓喜琴;噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性研究及評(píng)價(jià)[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2004年

7 王琳;結(jié)核分枝桿菌ClpX和ClpP2蛋白酶的克隆表達(dá)及其性質(zhì)研究[D];西南大學(xué);2010年

8 丁衛(wèi)民;耐多藥肺結(jié)核與結(jié)核分枝桿菌L型感染的臨床研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2003年

9 吳玉敏;1.結(jié)核分枝桿菌去標(biāo)簽Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4基因克隆及表達(dá) 2.FTY720對(duì)腎移植受者治療的安全性和有效性系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];蘭州大學(xué);2010年

10 佘茜;結(jié)核分枝桿菌PPE68蛋白的表達(dá)及初步應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2567227