【摘要】： 目的 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗;分析重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)效率;通過不同途徑接種疫苗,在MTB攻擊后,檢測實(shí)驗動物血清抗體及其亞類變化脾T淋巴細(xì)胞增殖脾T細(xì)胞CD4+和CD8+亞群變化以及脾細(xì)胞凋亡情況,從而初步闡述其保護(hù)性免疫機(jī)制,為結(jié)核病的防治提供一種有價值的疫苗。 方法 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增獲得ESAT-6和MPT64抗原編碼基因序列,然后采用序貫PCR(gene SOEing)法將ESAT-6和MPT64編碼基因用疏水甘氨酸接頭(Gly4Ser)3經(jīng)PCR擴(kuò)增融合,定向克隆入大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64;用電穿孔法將該質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 ( DE3 )及Bb ,構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌重組Bb-ESAT-6-MPT64疫苗。 SDS-PAGE及Western blot分析pGEX-ESAT-6-MPT64在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1～13h表達(dá)的目的蛋白。 為了研究rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后,抗MTB攻擊產(chǎn)生的免疫應(yīng)答及其保護(hù)性免疫機(jī)制,將65只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,每組13只。A組: rBb-ESAT-6-MPT64皮下注射;B組:rBb-ESAT-6-MPT64肌肉注射;C組:rBb-ESAT-6-MPT64鼻腔粘膜接種;D組:Bb皮下注射對照;E組:100μl PBS皮下注射對照。A、B組:5×106CFU疫苗懸浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下單次注射及肌肉注射;C組:5×105CFU疫苗懸浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜單次接種;D組:5×106CFU Bb懸浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下單次注射。5組均于疫苗免疫8w后用5×105CFU MTB鼻腔內(nèi)攻擊。在MTB攻擊感染后6w,用ELISA方法檢測各組鼠血清特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE抗體水平;用MTT比色法檢測脾細(xì)胞增殖水平;用FCM檢測脾細(xì)胞CD4+和CD8+亞群變化及用Annexin V-FITC試劑盒檢測脾細(xì)胞原液或ConA刺激培養(yǎng)時細(xì)胞凋亡發(fā)生率。 結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)PCR擴(kuò)增的ESAT-6-MPT64融合基因全長1020bp,序列分析發(fā)現(xiàn)其與預(yù)期結(jié)果一致;雙酶切證實(shí)ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中,成功構(gòu)建能夠表達(dá)目的蛋白的重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64;將含50μg/ml Amp的MRS瓊脂平板篩選的rBb經(jīng)PCR鑒定分析,證實(shí)pGEX-ESAT-6-MPT64成功轉(zhuǎn)進(jìn)Bb,rBb-ESAT-6-MPT64疫苗構(gòu)建成功。 SDS-PAGE及Western blot分析重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1～13h表達(dá)了60kDa的目的蛋白,占菌體總蛋白的22%,且能與人血清抗體發(fā)生特異結(jié)合。 疫苗免疫8W后用5×105CFU MTB H37Ra減毒株鼻腔內(nèi)進(jìn)行攻擊,在H37Ra攻擊感染后6w用ELISA法檢測抗體結(jié)果:A～C組中,小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均較對照組D、E組顯著增高,IgG3和IgE水平均較對照組D、E組無顯著差異;3組之間的相互比較:C組IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b水平較A、B組顯著增高,C組IgG3和IgE水平均較A、B組無顯著差異,A、B組之間各抗體水平無顯著差異。 用MTT法檢測的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果: A～C組中,小鼠脾細(xì)胞原液組、MTB刺激組或ConA刺激培養(yǎng)組淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均顯著高于D、E對照組,每個ConA刺激組增殖指數(shù)顯著高于相應(yīng)的原液組或MTB刺激組;每個MTB刺激組增殖指數(shù)顯著高于相應(yīng)的原液組;在原液組中,三組之間均無顯著性差異;在MTB刺激組中,C組鼻腔粘膜接種組增殖指數(shù)顯著高于B組肌肉注射組,余無顯著性差異;在ConA刺激組中,C組鼻腔粘膜接種組增殖指數(shù)顯著高于A組皮下注射組和B組肌肉注射組,A、B組之間無顯著性差異。 用FCM檢測CD4+和CD8+亞群水平結(jié)果:A～C組CD8+亞群水平均較D、E對照組增加,但均無顯著差異;A～C組CD4+亞群水平分別較D、E對照組有統(tǒng)計學(xué)意義增加;各組之間兩兩比較,C組CD4+亞群水平較A、B組有顯著性增加,余均無統(tǒng)計學(xué)意義。 用Annexin V-FITC試劑盒檢測小鼠脾細(xì)胞凋亡結(jié)果:A～C組中,小鼠脾細(xì)胞原液組或ConA刺激培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡發(fā)生率均顯著低于D、E對照組,每個ConA刺激組脾細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著高于相應(yīng)的原液組;C組鼻腔粘膜接種組脾細(xì)胞凋亡率顯著低于A組皮下注射組和B組肌肉注射組;A組皮下注射組脾細(xì)胞凋亡率顯著低于B組肌肉注射組。 結(jié)論 1.通過序貫PCR成功擴(kuò)增出ESAT-6-MPT64融合基因。 2.成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-ESAT-6-MPT64。 3.成功構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗。 4.結(jié)核分枝桿菌重組質(zhì)粒pGEX-ESAT-6-MPT64能在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)效率為22%,并且表達(dá)的重組蛋白具有特異的抗原性。 5.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性CD4+Th1型細(xì)胞免疫、體液免疫及微弱的CD8+CTL反應(yīng)。 6.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗鼻腔粘膜接種途徑誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生的保護(hù)性優(yōu)于皮下注射和肌肉注射途徑。
【圖文】：

e 1-2: ESAT-6-MPT64 PCR productLane 3: DNA MarkerIdentification of PCR product of ES-3 ESAT-6-MPT64 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒很多如陰離子去污劑法、苯酚抽近年來已逐漸被試劑盒所取代。有一層惰性大分子材料，能選擇核酸類物質(zhì)。作者在制備基因組Protein K 和去污劑裂解細(xì)菌釋放簡單的步驟即可除去非特異性結(jié)的 DNA。此法操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：2567227