【摘要】：目的:構(gòu)建弓形蟲RH株速殖子cDNA文庫并用慢性感染的小鼠血清對其進行免疫學(xué)篩選,以尋找有效的疫苗候選分子和早期診斷弓形蟲病的試劑。方法:收集、純化弓形蟲RH株速殖子,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,PCR合成cDNA雙鏈。經(jīng)過純化、sfi A B酶切、過柱除去小片段后,與λTriplEx2噬菌體載體兩臂連接包裝后形成弓形蟲RH株速殖子cDNA文庫。收集成囊株(Pruaniaud株)慢性感染的小鼠血清,經(jīng)濾膜吸附法去除血清中的大腸桿菌抗體,用以篩選弓形蟲RH株速殖子cDNA文庫。對3次復(fù)篩得到的陽性克隆進行插入片段的核苷酸序列測定,結(jié)果送GenBank進行同源性分析。根據(jù)序列測定結(jié)果,選取其中一個具有完整開放閱讀框架的基因進行分析。結(jié)果:初始文庫的容量為7.8×10~6個重組子,經(jīng)感染XLl-Blue菌擴增后,文庫的滴度達10~(10)pfu/ml。任意挑取克隆經(jīng)自身環(huán)化后提取質(zhì)粒,酶切后片段大小范圍為400-1200bp,重組率90%以上。用抗血清初篩了約7.2×10~4個重組的噬菌體,得到38個陽性克隆,對其中15個陽性克隆經(jīng)過三次復(fù)篩,得到4個持續(xù)陽性反應(yīng)克隆。通過對四個克隆進行測序并經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn),WT1克隆基因為弓形蟲P30基因;WT4克隆基為弓形蟲N-乙酰磷酸丙糖轉(zhuǎn)移酶基因;WT9克隆基因與現(xiàn)在已知的基因無同源性:WT12克隆基因與一未知的弓形蟲基因有很高的同源性,且具有一個513bp大小的完整的開放閱讀框架,通過對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測,它可能是一個跨膜信號蛋白。結(jié)論:本試驗成功地構(gòu)建了弓形蟲RH株速殖子cDNA文庫,篩選所得到的陽性克隆有望成為早期診斷抗原或保護性疫苗分子,值得進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392

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本文編號：2567217