胞外基質對大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響

發(fā)布時間：2019-11-27 15:59

【摘要】：骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)是骨髓系統(tǒng)一種具有多向分化潛能的干細胞,具有極強的自我復制能力,在特定的條件下可以分化為多種中胚層和部分外胚層來源的組織和細胞(如:成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、神經(jīng)細胞)。MSCs 取材方便,來源充足,自體MSCs 誘導分化后進行移植治療,解決了異體細胞免疫排斥反應的問題。由于MSCs 具有獨特的細胞增殖分裂模式,使外源基因易于導入和表達,而使其成為潛在的基因治療靶細胞,因而MSCs 逐漸成為一種重要的組織工程種子細胞。已有報道將骨髓MSCs 誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞,并在臨床上用于修復骨組織、軟骨組織的缺損。然而,目前骨髓間充質干細胞分離純化鑒定及體外培養(yǎng)尚沒有一致方案,有些方法相當繁瑣,不利于MSCs 培養(yǎng)的標準化及推廣,而且MSCs 體外培養(yǎng)生長較慢,原代培養(yǎng)的細胞兩周才能融合,傳代7 代以后增殖變得緩慢,并有自動分化為成骨細胞的可能。因此如何使MSCs 在體外快速的生長增殖,得到大量的純化的細胞就成為研究干細胞的前提和基礎。研究證實:胞外基質(Extracellular matrix,ECM)是組成間質和上皮-血管中基質的不溶性結構成分,它不僅僅是細胞機械支持組織,而且是供給營養(yǎng)和免疫應答的場所,參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育進程,決定細胞的粘附與遷移,在創(chuàng)傷修復和纖維化、細胞的生長、增殖、分化、代謝和腫瘤發(fā)生及轉移中起重要作用�；诖�,本實驗對成體大鼠的骨髓MSCs 進行了體外分離、培養(yǎng)和初步的組織化學檢測,并用胞外基質(膠原I、彈性蛋白)對其進行刺激,檢測增殖基因c-fos 的表達情況。力求尋找一個在體外促使MSCs 增殖的最佳胞外基質刺激條件,為其應用提供基礎實驗依據(jù)。方法: 本實驗采用1.073g/mL Percoll 細胞分離液密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結合的方法,體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞。3 天后首次換液,以后每4 天換液。待細胞融合后,消化傳代,使之逐漸純化。研究了其在體外傳代培養(yǎng)中的HE 染色、生長曲線、細胞周期等生物學特點。免疫組化方法檢測表面抗原CD34、CD44、膠原I(Collagen I) 、Fibronectin 的表達。用細胞誘導液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉,10~(-8) mmol/L 地塞米松,50 μg/mL 抗壞血酸)誘導其向成骨分化,并用改良的Gomori鈣鈷法檢測堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的表達來間接驗證分離獲得的MSCs 是否具有多向分化的能力。在此基礎上,用胞外基質(Collagen I 、彈性蛋白)刺激MSCs,噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖情況。刺激后,提取細胞總mRNA,用RT-PCR 檢測其增殖基因c-fos 的表達情況。
【圖文】：

均勻分布,剛接,細胞

慶大學碩士學位論文 2 大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)細胞（每個視野約 1-10 個），大小較均一，其核漿分界清楚，折光性強，，核絕大數(shù)為單核、圓形，位于細胞中央（如圖 2.2）。48-72h 后可以觀察到貼壁的細胞部分呈纖維狀，也有少量的為寬闊的平坦的三角狀、星狀等。未貼壁的細胞在液過程中被除去。接種 5-7 天，可見明顯的集落形成（如圖 2.3）。集落中的細胞斷擴增，呈反射狀、漩渦狀向周圍擴增，逐漸與臨近集落融合形成單層。此期細胞生長迅速，大約兩周原代培養(yǎng)的細胞相互融合可達到 85％的生長表面（如 2.4）。傳代培養(yǎng)后，細胞變?yōu)閳A形，核透亮（如圖 2.5），接種后 6-8h 開始貼壁，4h 之內(nèi)絕大部分細胞貼壁且成纖維狀，梭形，但是成均勻分布生長。更換培養(yǎng)基未貼壁的造血細胞排除，約 4-7 天傳代的細胞達到 90％融合，經(jīng)傳代培養(yǎng)后細的形態(tài)更加趨于一致。

大鼠,集落