【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)是骨髓系統(tǒng)一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,具有極強(qiáng)的自我復(fù)制能力,在特定的條件下可以分化為多種中胚層和部分外胚層來源的組織和細(xì)胞(如:成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)。MSCs 取材方便,來源充足,自體MSCs 誘導(dǎo)分化后進(jìn)行移植治療,解決了異體細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的問題。由于MSCs 具有獨(dú)特的細(xì)胞增殖分裂模式,使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá),而使其成為潛在的基因治療靶細(xì)胞,因而MSCs 逐漸成為一種重要的組織工程種子細(xì)胞。已有報(bào)道將骨髓MSCs 誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞,并在臨床上用于修復(fù)骨組織、軟骨組織的缺損。然而,目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化鑒定及體外培養(yǎng)尚沒有一致方案,有些方法相當(dāng)繁瑣,不利于MSCs 培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化及推廣,而且MSCs 體外培養(yǎng)生長(zhǎng)較慢,原代培養(yǎng)的細(xì)胞兩周才能融合,傳代7 代以后增殖變得緩慢,并有自動(dòng)分化為成骨細(xì)胞的可能。因此如何使MSCs 在體外快速的生長(zhǎng)增殖,得到大量的純化的細(xì)胞就成為研究干細(xì)胞的前提和基礎(chǔ)。研究證實(shí):胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)是組成間質(zhì)和上皮-血管中基質(zhì)的不溶性結(jié)構(gòu)成分,它不僅僅是細(xì)胞機(jī)械支持組織,而且是供給營(yíng)養(yǎng)和免疫應(yīng)答的場(chǎng)所,參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育進(jìn)程,決定細(xì)胞的粘附與遷移,在創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化、細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、代謝和腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起重要作用�；诖�,本實(shí)驗(yàn)對(duì)成體大鼠的骨髓MSCs 進(jìn)行了體外分離、培養(yǎng)和初步的組織化學(xué)檢測(cè),并用胞外基質(zhì)(膠原I、彈性蛋白)對(duì)其進(jìn)行刺激,檢測(cè)增殖基因c-fos 的表達(dá)情況。力求尋找一個(gè)在體外促使MSCs 增殖的最佳胞外基質(zhì)刺激條件,為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 本實(shí)驗(yàn)采用1.073g/mL Percoll 細(xì)胞分離液密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法,體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。3 天后首次換液,以后每4 天換液。待細(xì)胞融合后,消化傳代,使之逐漸純化。研究了其在體外傳代培養(yǎng)中的HE 染色、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期等生物學(xué)特點(diǎn)。免疫組化方法檢測(cè)表面抗原CD34、CD44、膠原I(Collagen I) 、Fibronectin 的表達(dá)。用細(xì)胞誘導(dǎo)液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉,10~(-8) mmol/L 地塞米松,50 μg/mL 抗壞血酸)誘導(dǎo)其向成骨分化,并用改良的Gomori鈣鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的表達(dá)來間接驗(yàn)證分離獲得的MSCs 是否具有多向分化的能力。在此基礎(chǔ)上,用胞外基質(zhì)(Collagen I 、彈性蛋白)刺激MSCs,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。刺激后,提取細(xì)胞總mRNA,用RT-PCR 檢測(cè)其增殖基因c-fos 的表達(dá)情況。
【圖文】：

慶大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)細(xì)胞（每個(gè)視野約 1-10 個(gè)），大小較均一，其核漿分界清楚，折光性強(qiáng)，，核絕大數(shù)為單核、圓形，位于細(xì)胞中央（如圖 2.2）。48-72h 后可以觀察到貼壁的細(xì)胞部分呈纖維狀，也有少量的為寬闊的平坦的三角狀、星狀等。未貼壁的細(xì)胞在液過程中被除去。接種 5-7 天，可見明顯的集落形成（如圖 2.3）。集落中的細(xì)胞斷擴(kuò)增，呈反射狀、漩渦狀向周圍擴(kuò)增，逐漸與臨近集落融合形成單層。此期細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，大約兩周原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互融合可達(dá)到 85％的生長(zhǎng)表面（如 2.4）。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞變?yōu)閳A形，核透亮（如圖 2.5），接種后 6-8h 開始貼壁，4h 之內(nèi)絕大部分細(xì)胞貼壁且成纖維狀，梭形，但是成均勻分布生長(zhǎng)。更換培養(yǎng)基未貼壁的造血細(xì)胞排除，約 4-7 天傳代的細(xì)胞達(dá)到 90％融合，經(jīng)傳代培養(yǎng)后細(xì)的形態(tài)更加趨于一致。

大鼠MSCs形成集落100×Fig.2.3CFU-FofratMSCs100×
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2566669