【摘要】：第一部分 人糖代謝相關(guān)蛋白-1的蛋白表達與功能的初步研究 目的 克隆和表達人糖代謝相關(guān)蛋白-1(GMRP-1)基因，初步揭示GMRP-1的功能。 方法 RT-PCR克隆GMRP-1基因全長，，將GMRP-1基因構(gòu)建到原核表達載體pET-32a與真核表達載體pEGFP—C3，在E.col ROSSET(DE3)菌中高效表達并純化GMRP-1融合蛋白，免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體；利用共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在HEK293細胞中的定位。利用Northern Blot與Western Blot技術(shù)觀察了GMRP-1基因和蛋白表達譜，利用雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在胰腺中的定位。同時利用Northern Blot與Western Blot技術(shù)觀察不同濃度葡萄糖不同作用時間對β-TC3細胞GMRP-1的基因和蛋白表達的影響。通過轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)觀察GMRP-1與β-TC3細胞胰島素分泌的關(guān)系。結(jié)果 成功制備特異性好、效價較高的多克隆抗體。激光共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位于HEK293細胞的細胞漿中。GMRP-1表達廣泛，其中在腦、骨骼肌、脂肪、肝臟、主動脈、十二指腸及β細胞株β-TC3中表達較高。雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位在胰島中，在胰腺的外分泌腺中沒有表達，同時GMRP-1與胰島素有部分的重疊。葡萄糖對β-TC3細胞GMRP-1表達的影響呈劑量和時間依賴性關(guān)系，葡萄糖濃度增加，GMRP-1表達增加，20mmol／L濃度下表達最高。葡萄糖作用時間增加，GMRP-1表達增加，72小時表達最高。β-TC3細胞過表達GMRP-1及RNA干擾技術(shù)沉默β-TC3細胞GMRP-1表達后，胰島素分泌沒有明顯的差異。結(jié)論 GMRP-1特異性定位于大鼠胰島中，葡萄糖可以調(diào)控它在胰島β細胞中的表達，它在高糖導(dǎo)致的胰島β細胞功能變化中發(fā)揮重要的作用，它與β細胞胰島素分泌之間沒有直接的關(guān)系。 第二部分 人新型鈉鈣交換蛋白NCEx的蛋白表達與功能的初步研究 目的 克隆和表達人新型鈉鈣交換蛋白NCEx基因，初步揭示NCEx與糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系。方法 RT-PCR克隆NCEX基因全長；將NCEX基因構(gòu)建到綠色熒光真核表達載體pEGFP—C3，利用共聚焦顯微鏡觀察NCEX在HEK293細胞與小鼠胰島素瘤β-TC3細胞中的定位。熒光分光光度儀觀察細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。Western印跡檢測NCEx在高血糖猴各組織與2型糖尿病主動脈組織NCEX蛋白的差異表達，RT-PCR檢測NCEX基因在人主動脈平滑肌細胞(HASMC)、人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)和人血管巨噬細胞(THP-1)細胞中的表達及不同葡萄糖濃度對其基因表達的影響，Northern blotting雜交驗證高糖作用HAEC細胞NCEX mRNA的表達差異。結(jié)果 重組載體pGFP-C3—NCEX轉(zhuǎn)染后，定位于HEK293細胞與β-TC3細胞的細胞膜上。熒光分光光度儀觀察到NCEx過表達后HEK293細胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對照組，并有顯著統(tǒng)計學差異。當細胞外145 mmol／L的Na~+完全由145mmol／L的Li~+置換后，NCEx過表達的HEK293細胞內(nèi)Ca2+濃度出現(xiàn)大幅度的升高，在測定過程中加入終濃度為5mmol／L KCl時，對細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化沒有影響。同時發(fā)現(xiàn)NCEx蛋白在高血糖猴與糖尿病患者主動脈中表達上調(diào)，而在其他組織中無差異表達。同時發(fā)現(xiàn)NCEx主要表達在HAEC中，而HASMC和THP-1表達量低，RT-PCR和Northern Blotting結(jié)果顯示NCEx基因在血管內(nèi)皮細胞的表達受到血糖的調(diào)控，作用72小時后，隨著D-葡萄糖濃度的升高，NCEx基因表達逐漸增加。結(jié)論NCEx的雙向轉(zhuǎn)運模式主要以逆向轉(zhuǎn)運模式即將細胞外Ca2+轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)為主。NCEx在糖尿病大血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要的作用。
【圖文】：

復(fù)旦大學博士研究生畢業(yè)論文已經(jīng)得到表達量較高的GMRP一1融合蛋白(見圖1一5)。同時通過超聲粉碎菌體后取上清和沉淀行SDS一PAGE電泳，顯示目的蛋白在沉淀即包涵體中表達，而上清中無表達(見圖1一6)。 234 234”6目~撇咤翻日，一，鷺娜嶸肇一

本文編號：2563819