【摘要】： 前言 鋁的神經(jīng)毒性作用日益引起人們的重視。已有研究發(fā)現(xiàn)，鋁最容易引起神經(jīng)元損傷，影響智力發(fā)育，且鋁導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，是一個長期的慢性的病理過程，涉及到腦發(fā)育的各個階段。大量研究表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、透析綜合癥、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等均與慢性鋁蓄積有關(guān)。因此，對鋁中毒尋找有效的預(yù)防與治療措施具有重大的臨床意義。 通過對鋁中毒患者進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)有過量的鋁蓄積時，會引起血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的結(jié)構(gòu)和功能損傷。同時發(fā)現(xiàn)，鋅對于此種損傷具有一定的保護(hù)作用，但是濃度過高反而會引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。 本研究旨在探討不同濃度的鋅對腦內(nèi)鋁含量的影響，以便尋找出最佳給藥濃度來保護(hù)鋁對腦的損傷，從而為預(yù)防慢性鋁金屬中毒和采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧┨峁├碚撘罁?jù)。 材料和方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1．實(shí)驗(yàn)動物出生40天的清潔級SD大鼠300只，體重80±10g。 2．主要試劑分析純六水合氯化鋁(AlCl_3·6H_2O)；硫酸鋅(ZnSO_4)；伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)；考馬斯亮藍(lán)G250；兔抗鼠血管緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin單克隆抗體；化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒；過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽熒光染色劑。 3．主要儀器Morris水迷宮裝置；Spectronic 21型的紫外-可見分光光度計；JEM-1200EX型透射電鏡；通用電泳儀、凝膠電泳成像系統(tǒng)；低溫冷凍離心機(jī)；正置熒光顯微鏡；恒溫冷凍切片機(jī)。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、分組 健康40日齡SD大鼠300只，按體重隨機(jī)分到下列各實(shí)驗(yàn)組中，分別為：A對照組；B低鋁組；C中鋁組；D高鋁組；E低鋅組；F高鋅組；G中鋁+低鋅組；H中鋁+高鋅組；I高鋁+低鋅組；J高鋁+高鋅組。 2、給藥 腹腔注射無菌的生理鹽水或低、中、高濃度AlCl_3溶液，造成鋁中毒；口腔灌胃給予低、高濃度ZnSO_4溶液。每連續(xù)處理3天間歇1天，共計8個周期。 3、定期檢測動物體重增長情況。 4、利用經(jīng)典Morris水迷宮檢測各組動物的學(xué)習(xí)記憶能力。 5、測定腦組織EB含量來判斷各組動物BBB通透性的改變。 6、應(yīng)用透射電鏡觀察腦超微結(jié)構(gòu)的變化。 7、免疫組化熒光染色和正置熒光顯微鏡觀察毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)情況。 8、免疫組化SABC染色法觀察緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的分布位置以及表達(dá)水平的變化。 9、Western blot法測定緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的含量變化。 10、統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0(statistical package for the social science，SPSS)統(tǒng)計分析處理軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、各組動物體重增長情況 對照組大鼠體重增長值(115.6±4.8g)與中鋁組(82.4±22.2g)、高鋁組(55.8±6.80g)相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05；中鋁組(82.4±22.2g)與中鋁+低鋅組(108.8±12.4g)、中鋁+高鋅組(107.0±9.59g)相比均具有顯著差異，P＜0.01；高鋁組(55.8±6.80g)與高鋁+低鋅組(93.0±4.47g)、高鋁+高鋅組(105.0±10.0g)相比均具有顯著差異，P＜0.01。 二、Morris水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 各組之間的大鼠逃避潛伏期和空間定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。 三、BBB通透性的變化 對照組的腦組織EB含量(0.011±0.003μg／g腦重量)與低鋁組(0.053±0.007μg／g腦重量)、中鋁組(0.085±0.012μg／g腦重量)、高鋁組(0.110±0.021μg／g腦重量)相比均具有顯著差異，P＜0.01；中鋁組(0.085±0.012μg／g腦重量)與中鋁+低鋅組(0.036±0.004μg／g腦重量)、中鋁+高鋅組(0.031±0.002μg／g腦重量)相比均具有顯著差異，P＜0.01；高鋁組(0.110±0.021μg／g腦重量)與高鋁+低鋅組(0.061±0.003μg／g腦重量)、高鋁+高鋅組(0.042±0.006μg／g腦重量)相比均具有顯著性差異，P＜0.01。 四、透射電鏡觀察腦超微結(jié)構(gòu)的變化 電鏡結(jié)果顯示，對照組動物腦BBB緊密連接結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞核近似圓形、核膜清晰，染色質(zhì)，線粒體、高爾基體等均具有完整結(jié)構(gòu)；中鋁、高鋁組大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的變形，線粒體和高爾基體偶有水腫，高鋁組伴有異染色質(zhì)向細(xì)胞核膜的邊集，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接模糊，電子密度高；中鋁+低鋅組、中鋁+高鋅組、高鋁+高鋅組動物腦BBB的超微結(jié)構(gòu)保持較完整，功能較正常，但也偶有內(nèi)皮細(xì)胞核的輕微分裂，緊密連接開放。 五、免疫組織化學(xué)熒光染色觀察微細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的骨架蛋白F-actin的表達(dá) 在熒光顯微鏡下，對照組動物腦內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin呈紅色絲狀，沿血管壁均勻表達(dá)；中鋁組、高鋁組動物腦內(nèi)的微血管的F-actin表達(dá)模糊，有不連接的現(xiàn)象，可見血管壁有不同程度的皺縮、變形；低鋁組、低鋅組、中鋁+高鋅組腦微血管較為規(guī)則，絲狀F-actin沿血管壁均勻表達(dá)，連續(xù)、明亮、清晰。 六、免疫組化SABC染色法觀察緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的分布位置以及表達(dá)水平的變化 組織化學(xué)研究結(jié)果顯示，occludin表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞毗鄰處，呈點(diǎn)狀和線狀表達(dá)；對照組大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的平均光密度值(0.255±0.010)與中鋁組(0.219±0.008)、高鋁組(0.207±0.004)相比均具有顯著差異，P＜0.05；中鋁組(0.219±0.008)與中鋁+低鋅組(0.236±0.005)、中鋁+高鋅組(0.250±0.004)相比均具有顯著差異，P＜0.01；高鋁組與高鋁+低鋅組(0.229±0.003)、高鋁+高鋅組(0.242±0.003)相比均有顯著差異，P＜0.01。 七、Western blot法測緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的含量變化 中鋁組大鼠腦組織中occludin(62-80KD)的相對光密度值(0.585±0.012)和對照組(0.701±0.048)、中鋁+高鋅組(0.661±0.004)相比均具有顯著差異，P＜0.01；高鋁組(0.427±0.003)與高鋁+低鋅組(0.565±0.003)、高鋁+高鋅組(0.678±0.014)相比，均具有顯著差異，P＜0.01。 討論 BBB對于保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定起重要作用，也是鋁對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用的門戶。過量鋁接觸導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶等方面的功能障礙，是一個長期慢性神經(jīng)病理過程并涉及腦發(fā)育的各個階段。本研究所選的動物為出生40天的未成年SD大鼠，染毒期為32天，這與以往實(shí)驗(yàn)所選擇的動物年齡和染毒時間不同。本研究的水迷宮結(jié)果提示，短期低濃度的鋁并未對動物學(xué)習(xí)記憶方面造成明顯的影響，由此再次證明了鋁導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶方面功能障礙的長期慢性毒性作用。 BBB保持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)之一。透射電鏡、免疫組織化學(xué)分析和western blot檢測結(jié)果表明：各染毒組動物BBB超微結(jié)構(gòu)和通透性與正常組相比均有所變化，鋁對組成BBB的各部分細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體和高爾基體都有所損傷，并且導(dǎo)致了緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的減少及F-actin表達(dá)的改變、局部BBB的開放，而且隨著鋁染毒劑量的增加，BBB通透性逐漸增加。 鋅是人體必需的微量元素之一，參與體內(nèi)多種酶和功能蛋白的組成，影響細(xì)胞增殖、分化，參與核酸、蛋白質(zhì)的代謝，維持正常的細(xì)胞周期，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的鋅對鋁導(dǎo)致的未成年大鼠BBB的完整性的破壞具有一定的保護(hù)作用，可以緩解鋁引起的BBB結(jié)構(gòu)的改變和通透性的升高；本研究的免疫組織化學(xué)染色和western blot結(jié)果首次證明：鋁影響了大鼠BBB內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，而且隨著鋁染毒劑量的增加，occludin的表達(dá)顯著減少。免疫組織化學(xué)熒光染色結(jié)果表明：過量鋁接觸影響B(tài)BB的細(xì)胞骨架蛋白F-actin的表達(dá)。上述結(jié)果提示occludin表達(dá)的減少及F-actin表達(dá)的改變可能是鋁導(dǎo)致BBB通透性升高的直接原因之一。 鋅雖然具有廣泛的生理生化功能，但是過高濃度和盲目的使用也會影響正常的生理功能，本研究所選擇的高鋅組動物的BBB的結(jié)構(gòu)和功能與對照組相比有明顯差異，可以推測，本研究中的高濃度鋅可以逆轉(zhuǎn)鋁導(dǎo)致的未成年大鼠BBB的通透性的升高，保持BBB正常的超微結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，可以考慮用來作為某種病理?xiàng)l件下的治療用量，但高濃度鋅不適宜作為正常生理?xiàng)l件下的日常膳食補(bǔ)充。 緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和F-actin的變化提示鋁的毒性作用可能與其改變BBB的通透性和完整性相關(guān)，這可能是鋁對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的初步損傷，這些損傷的長期積累可能誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)元的病理改變，但長期鋁接觸導(dǎo)致BBB的變化以及BBB的變化與神經(jīng)元病理變化的相關(guān)性還有待進(jìn)一步的研究。未成年動物具有BBB結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育不完善等特點(diǎn)，與成年動物相比更易受到損傷和破壞，且損傷程度會更大，波及范圍更廣。因此，繼續(xù)研究鋅對鋁接觸導(dǎo)致的中樞神經(jīng)毒性作用的保護(hù)作用，可能對未成年動物的鋁接觸尋找出更有效的拮抗劑，同時可能為鋁中毒提供新的防護(hù)途徑。 結(jié)論 1．小于10mg／kg濃度的鋁接觸顯著降低了未成年SD大鼠的體重增長，但未對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生明顯的影響。 2．2.5mg／kg濃度的鋁增加了未成年大鼠BBB的通透性；大于5mg／kg濃度的鋁接觸增加了BBB的通透性，損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，顯著降低了緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，改變了F-actin的表達(dá)。 3．5mg／kg的鋅未對未成年動物體重、BBB的通透性和超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的影響；10mg／kg的鋅顯著降低了未成年SD大鼠的體重增長，增加了BBB的通透性，損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，且影響了occludin和F-actin的表達(dá)。 4．鋅對鋁接觸導(dǎo)致的未成年大鼠體重增長緩慢具有顯著的改善作用。鋅對鋁接觸導(dǎo)致的未成年大鼠BBB的通透性的增加和超微結(jié)構(gòu)的破壞具有明顯的保護(hù)作用，鋅顯著抑制了緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和F-actin的表達(dá)改變。
【圖文】：

圖1各實(shí)驗(yàn)組動物體重增長情況(n=10)與對照組相比，*尸<0.05;與中鋁組相比，“P<0.01;與高鋁組相比，‘尸<0.01二、經(jīng)典Morris水迷宮檢測各處理組動物間學(xué)習(xí)記憶能力給藥結(jié)束后，每組大鼠取10只進(jìn)行連續(xù)5天的水迷宮測試，記錄各組大鼠的逃避潛伏期和空間定位航行情況，檢測各組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(表l)。

組 (0.031士0.002林創(chuàng)g腦重量)相比均具有顯著差異，尸<0.01;高鋁組 (0.11肚0.021拌眺腦重量)與高鋁十低鋅組 (0.061士0.003林吮腦重量)、高鋁+高鋅組(0.04肚0.006林9/9腦重量)相比均差異顯著，，尸<0.01(圖2)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363

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