發(fā)布時間：2019-10-30 13:13

【摘要】： 目的:選擇編碼炭疽桿菌保護(hù)性抗原PA(protective antigen)的基因Pag,以炭疽桿菌A16R菌株為模板,克隆炭疽桿菌Pag基因,構(gòu)建表達(dá)載體并在原核細(xì)胞中進(jìn)行功能性表達(dá),為炭疽桿菌亞單位疫苗的研制提供基礎(chǔ)。 方法:參考Pet-32a載體序列多克隆位點(diǎn),根據(jù)Pag基因序列設(shè)計引物,通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)獲得目的片段,測序正確后構(gòu)建到原核表達(dá)載體Pet-32a,構(gòu)建載體命名Pet-32a-PA。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),通過ELISA和Western-Blot等方法進(jìn)行特異性鑒定。 結(jié)果:構(gòu)建出Pet-32a-PA表達(dá)載體,經(jīng)DNA序列分析和雙酶切鑒定證實質(zhì)粒構(gòu)建正確,并均能在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)內(nèi)表達(dá)。其表達(dá)形式為包涵體,經(jīng)過變性、純化、復(fù)性后通過ELISA和Western-Blot證實得到了具有活性的PA蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建出Pet-32a-PA表達(dá)載體,其蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過復(fù)性后具有活性,為炭疽亞單位疫苗的研制提供了基礎(chǔ)。
【圖文】：

1.3 SDS-PAGE 鑒定 rPA 原核表達(dá)蛋白重組 pET32a/PA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）表達(dá)菌，經(jīng)過 IPTG和誘導(dǎo)前表達(dá)菌對照相比，表達(dá)菌經(jīng)誘導(dǎo)后在 90kDa 左右有較量與預(yù)期一致。1.4 分析重組蛋白在大腸桿菌中的存在形式及 Western blot如圖 2-3 PA 重組蛋白是以包涵體形式存在，表達(dá)菌超聲后，Western blot 結(jié)果證明重組蛋白能夠與小鼠抗 PA 單抗特異性圖 2-1 PCR 鑒定重組質(zhì)粒1：Marker DL30002：PCR product of pET32a/PA圖 2-2 雙酶切鑒定重組 pET32a/P1：Marker DL30002：pET32a/PA digested by Kpn

1.3 SDS-PAGE 鑒定 rPA 原核表達(dá)蛋白重組 pET32a/PA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）表達(dá)菌，，經(jīng)過 IPTG和誘導(dǎo)前表達(dá)菌對照相比，表達(dá)菌經(jīng)誘導(dǎo)后在 90kDa 左右有較量與預(yù)期一致。1.4 分析重組蛋白在大腸桿菌中的存在形式及 Western blot如圖 2-3 PA 重組蛋白是以包涵體形式存在，表達(dá)菌超聲后，Western blot 結(jié)果證明重組蛋白能夠與小鼠抗 PA 單抗特異性圖 2-1 PCR 鑒定重組質(zhì)粒1：Marker DL30002：PCR product of pET32a/PA圖 2-2 雙酶切鑒定重組 pET32a/P1：Marker DL30002：pET32a/PA digested by Kpn
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何穎;汪炬;張志成;劉雪婷;洪岸;;FGFR2Ⅲc胞外段的原核表達(dá)及其對前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J];中國生物工程雜志;2009年07期

2 羅良生,王愛東,黃強(qiáng);抗膠質(zhì)瘤重組免疫毒素SZ39-PE40的原核表達(dá)、純化及復(fù)性研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2002年04期

3 李明,Jan-Christer Janson,蘇志國;蛋白質(zhì)在層析過程中的失活與復(fù)性[J];化工學(xué)報;2004年07期

4 方敏,黃華j;包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報;2001年06期

5 段金柱,齊財,韓偉,王戰(zhàn)會,靳剛,閻錫蘊(yùn);抗SARS人源單鏈抗體H12的表達(dá)及復(fù)性[J];生物工程學(xué)報;2005年05期

6 唐松山，劉鐘濱;大腸桿菌外源基因表達(dá)產(chǎn)物的下游技術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;1995年03期

7 朱慧,劉偉,史蔚,薛宇鳴,馬忠;重組人尿激酶原的體外變復(fù)性研究[J];生物工程學(xué)報;2000年02期

8 劉玉應(yīng);鄧小晨;劉忠榮;吳洽慶;陳松森;;重組人干細(xì)胞因子中試工藝研究[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;2008年02期

9 羅惠霞;李敏;王玉炯;田楠;;rPA(K)原核表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性與純化[J];河北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年01期

10 林蘭;劉建文;楊化新;王廣基;;胰核糖核酸酶A的原核表達(dá)及純化復(fù)性研究[J];藥物生物技術(shù);2009年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 許曉群;鄭瑞;張建華;王郡甫;高春義;;重組人IL-21的原核表達(dá)及其復(fù)性與純化[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

2 姚清俠;錢平;李祥敏;徐卓菲;郭東春;金梅林;陳煥春;;豬γ-干擾素的分子克隆與在大腸桿菌中的表達(dá)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2004年

3 葉明強(qiáng);楊婉瑩;鄧小娟;韓冬;曹陽;溫碩洋;夏慶友;;家蠶擬抗微生物肽Bmatt 1基因的原核表達(dá)及抗菌活性鑒定[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)研討會論文集[C];2009年

4 王杭軍;葉星;田園園;張莉莉;瞿蘭;;草魚呼腸孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白原核表達(dá)研究[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

5 孟先明;潘艷;蔡新斌;陸專靈;梁湘;唐海波;楊劍;張紅普;羅廷榮;;狂犬病毒ERA株基質(zhì)蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

6 彭躍躍;丁q

本文編號：2553829