【摘要】： 抗CD3單克隆抗體OKT3自1986年被FDA批準(zhǔn)用于臨床以來，在腎、心臟、骨髓等實(shí)體及非實(shí)體器官移植后的抗排斥反應(yīng)中有著廣泛的應(yīng)用，近年來在Ⅰ型糖尿病等自身免疫病的治療中也取得了良好的臨床療效。但是抗CD3抗體與Fc受體相互作用引起的絲裂原活性以及鼠抗體的免疫原性給抗體的臨床應(yīng)用帶來嚴(yán)重的毒副作用。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者分別通過抗體人源化以及對(duì)抗體中參與與Fc受體相互作用的位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變來降低抗體的免疫原性和絲裂原活性，國(guó)外已有相應(yīng)的產(chǎn)品進(jìn)入各期臨床試驗(yàn)，取得很好的臨床效果。因此，研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型無絲裂原活性的抗CD3抗體具有重要的理論和實(shí)際意義。 本論文在本室保存的抗CD3鼠源性單抗yCD3的基礎(chǔ)上，借助本實(shí)驗(yàn)室建立的“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺(tái)，設(shè)計(jì)了新型的無絲裂原活性的抗CD3小分子抗體mini-yCD3，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了抗體的部分人源化，并且對(duì)新型抗體的功能及作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討。具體研究結(jié)果如下： 1、釣取了抗CD3鼠源性單抗yCD3的重輕鏈抗體基因，構(gòu)建表達(dá)了抗CD3嵌合抗體，對(duì)抗體的功能進(jìn)行了初步鑒定。所構(gòu)建的抗CD3嵌合抗體可以與CD3~+細(xì)胞系Jurkat以及外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC特異性結(jié)合。在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中顯示了良好的免疫抑制活性。 2、借助“基于抗原—抗體相互作用結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新型結(jié)構(gòu)抗體分子”技術(shù)平臺(tái)，，優(yōu)化設(shè)計(jì)了新型小分子抗體mini-yCD3，其結(jié)構(gòu)模式為VH—Linker—VL—hinge—Human IgG1 CH_3 domain。利用距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)對(duì)絞鏈區(qū)進(jìn)行分析改造，使兩條mini-yCD3單鏈結(jié)構(gòu)通過絞鏈區(qū)的二硫鍵形成穩(wěn)定的雙價(jià)結(jié)構(gòu)。理論數(shù)據(jù)顯示，該小分子抗體可以與兩個(gè)CD3抗原結(jié)合，其作用模式與親本抗體相似。 3、通過在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，獲得了小分子抗體mini-yCD3，在體外對(duì)該抗體的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果與理論預(yù)測(cè)一致，該新型抗體在非還原條件下以二聚體形式存在，保持了與親本抗體一致的親和力、免疫抑制活性以及下調(diào)T細(xì)胞表面CD3分子表達(dá)水平的能力；同時(shí)新型抗體沒有明顯地引起T細(xì)胞的活化，也未引起明顯的IL-2、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子的釋放。也就是說，設(shè)計(jì)的新型小分子抗體mini-yCD3呈天然雙價(jià)結(jié)構(gòu)，保持了親本抗體的親和力和免疫抑制活性，大大的降低了抗體的絲裂原活性。 4、選擇T細(xì)胞活化途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：CD3分子ζ鏈的磷酸化以及Zap70的募集、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化和NFAT入核等，對(duì)新型小分子抗體與親本抗體介導(dǎo)T細(xì)胞活化信號(hào)的差異進(jìn)行分析，初步探討了不同結(jié)構(gòu)抗體介導(dǎo)T細(xì)胞不同活性的分子機(jī)制。鼠單抗yCD3的刺激可以引起CD3ζ鏈的充分磷酸化，而在小分子抗體mini-yCD3作用后，CD3ζ鏈的磷酸化水平僅維持在一個(gè)較低的水平。經(jīng)yCD3充分激活的CD3ζ鏈可以有效地引起ZAP70的募集活化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高、NFAT的入核以及IL-2的表達(dá)，最后導(dǎo)致T細(xì)胞的完全活化；而小分子抗體mini-yCD3雖然在高濃度作用下可以提高一定的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，但是不足以激活后續(xù)的通路，因此不能完全活化T細(xì)胞。
【圖文】：

博士論文前一言前言CD3分子廣泛分布于T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞表面，有五種亞基:丫，6，。，屯和n，在8小90%T細(xì)胞中以今Y一。一6一屯弋的形式存在，另1小20%T細(xì)胞中則以。一丫一卜6一屯的形式存在。eo3分子與T細(xì)胞受體(theTeellreeeptor，TCR)組成TCR/CD復(fù)合物，參與T細(xì)胞識(shí)別抗原并轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞識(shí)別抗原后的刺激信號(hào)，在T細(xì)胞介的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用(圖l)川。Str“‘tur一ofCO3PolyP.Pt示d二’丁

圖2.抗CD3抗體介導(dǎo)T細(xì)胞免疫抑制功能的四種可能途徑抗CD3抗體在臨床應(yīng)用中獲得良好療效的同時(shí)，存在兩個(gè)嚴(yán)重的毒副作用。首先是抗體的鼠源性會(huì)引起人抗小鼠反應(yīng)(HAMA反應(yīng))，作為異源蛋白在人體內(nèi)能迅速地被清除，嚴(yán)重地影響了抗體的療效以及抗體的再次使用〔’“，’7」。目前主要通過抗體人源化、制備人源抗體等手段來減弱抗體的鼠源性，降低HAMA反應(yīng)，延長(zhǎng)半衰期�？笴D3抗體的另一個(gè)毒副作用是由其絲裂原活性引起的。在體外，它可以引起T細(xì)胞的增殖和大量細(xì)胞因子的釋放(TNF，IFN一丫，IL一2，IL一3，IL一4，IL一6，IL一10等)[’“，，”]。在體內(nèi)，它會(huì)引起嚴(yán)重的急性“流感樣”綜合癥，伴隨著大量的細(xì)胞因子釋放，表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、震顫、胸痛和胸悶、呼吸困難、惡心嘔吐、腹瀉以及血壓變化等癥狀，較嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致肺水腫，個(gè)別嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡120一29]。一系列的研究表明，抗CD3抗體的絲裂原活性是由于抗CD3抗體的Fc
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 邵文雨;乙肝陽性肝移植病人外周血中HBV特異性CTL頻度和急性排斥發(fā)生關(guān)系研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2553321