【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)作為一種非細胞毒性的嗜肝病毒，感染機體后將導致急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等一系列肝臟疾病的發(fā)生，成為危害人類健康的一項嚴重問題。機體對病毒抗原的免疫反應是HBV引起肝臟疾病的重要機制，但目前HBV確切的致病機理仍不清楚。隨著肝臟天然免疫系統(tǒng)的提出，肝臟內(nèi)天然免疫細胞在HBV感染致病過程中的作用引起了學者們的重視，尤其是肝臟NK細胞。肝臟內(nèi)聚集著大量的NK細胞，約占肝臟淋巴細胞總數(shù)的35％。NK細胞在機體抗HBV感染中起著不可忽視的作用，但是在HBV感染肝臟免疫致病過程中的作用及其可能的機制還有待于進一步的研究證實。值得注意的是人類HBV健康攜帶者再受到外界因素如病毒、細菌等感染、化學物質(zhì)、細胞刺激劑、妊娠及免疫治療等作用后肝細胞極易發(fā)生損傷，嚴重危害這一人群的健康。有研究提示NK細胞參與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟易損傷過程，但是NK細胞通過何種機制參與肝細胞敏感損傷尚未闡明。 故本研究利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL／6J-TgN(AlblHBV)44Bri，一種模擬人類HBsAg健康攜帶者的模型，深入探討肝臟天然免疫細胞在HBV感染肝臟免疫損傷中的作用及機理。首先分析比較HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中樞及外周免疫系統(tǒng)中各類淋巴細胞的存在狀態(tài)，尤其是肝臟NK細胞的基本特性；利用多種刺激劑如Poly I：C，Con A及CCl_4研究HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷情況，并進一步探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞的免疫應答特性及在肝臟損傷中的作用。實驗過程中，采用賴氏法檢測血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST水平、組織H-E染色觀察肝臟病理學變化，并利用上述指標綜合評估肝細胞損傷程度；通過細胞清除和細胞過繼轉(zhuǎn)輸技術(shù)，研究特定淋巴細胞群在肝臟損傷過程中的作用以及細胞間相互作用關(guān)系；采用流式細胞術(shù)測定各淋巴細胞亞群的表型，活化狀態(tài)以及細胞因子分泌功能；利用Western blotting方法檢測肝細胞胞內(nèi)信號傳導；運用特異抗體中和實驗觀察細胞間相互作用的分子機制；運用特異性抗體阻斷實驗以及體外AST釋放實驗探索淋巴細胞與肝細胞間相互作用機制。通過上述研究方案獲得如下結(jié)果： 1．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞特性改變 與正常野生型小鼠相比，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞數(shù)量明顯減少；自然活化程度(CD69表達水平)明顯下降；對腫瘤細胞的細胞毒活性明顯受損；表面TRAIL分子的表達水平明顯下降。而且，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞對Poly I：C的免疫應答不同于正常野生型小鼠。雖然Poly I：C能夠刺激HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞的聚集、活化、并提高其對腫瘤細胞的細胞毒活性，但是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠活化的肝臟NK細胞細胞毒活性仍明顯低于正常野生型小鼠。 2．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷敏感性明顯增加 低劑量Poly I：C(3μg／g body weight)誘導HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST急劇升高，嚴重的肝細胞壞死和肝臟炎性浸潤，與高劑量Poly I：C(30μg／g body weight)的作用基本相同；而在正常野生型小鼠，僅高劑量Poly I：C的作用引起血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST的輕度上升。 低劑量Con A(3μg／g body weight)刺激下，正常野生型小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST仍在正常范圍內(nèi)；而HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST急劇升高，肝臟有明顯的大片壞死灶及炎性浸潤。足劑量Con A(15μg／g body weight)作用后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率明顯高于正常野生型小鼠。 另外，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對于化學毒物CCl_4誘導的肝細胞損傷敏感性也顯著增加。刺激24h后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT急劇上升，顯著高于正常野生型小鼠。 3．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對Poly I：C誘導的肝臟損傷敏感性增加的機制：NK細胞及IFN-γ依賴途徑 細胞清除實驗表明HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，低劑量Poly I：C(3μg／g body weight)誘導的肝細胞敏感損傷依賴于NK細胞。低劑量Poly I：C刺激后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)活化的NK細胞分泌大量IFN-γ。中和體內(nèi)IFN-γ后，低劑量Poly I：C誘導的肝臟敏感損傷明顯減弱。給予外源性重組IFN-γ后血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST水平表明HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對IFN-γ誘導的肝細胞損傷作用更為敏感。進一步研究發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細胞表面IFN-γ受體的表達水平明顯高于正常野生型小鼠，而且低劑量Poly I：C刺激明顯提高其表達。在IFN-γ刺激后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細胞胞內(nèi)信號pSTAT1-IRF-1明顯強于正常野生型小鼠肝細胞。 另外，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠Poly I：C誘導的肝臟敏感損傷過程中，，NK細胞發(fā)揮作用不依賴于Kupffer細胞及IL-12。 4．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對Con A誘導肝臟損傷極度敏感的機制：NKG2D依賴途徑 細胞轉(zhuǎn)輸實驗證明在低劑量Con A(3μg／g body weight)誘導肝細胞損傷過程中，與正常野生型小鼠相比HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟淋巴細胞對肝細胞的殺傷活性明顯增強，同時HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細胞對淋巴細胞的殺傷作用更為敏感。低劑量ConA作用下，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)聚集著更多的活化NK細胞，而且低劑量Con A誘導的肝臟敏感損傷依賴于NK細胞。純化的NK細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)輸實驗證明低劑量Con A活化的肝臟NK細胞具有肝細胞毒活性，是肝細胞損傷的效應細胞。 Con A刺激后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細胞不同于正常野生型小鼠肝細胞，其NKG2D配體(Rae-1和Mult-1)的表達明顯上調(diào)。阻斷HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D通路后，低劑量Con A誘導的肝細胞損傷明顯減弱。體外純化的NK細胞對肝細胞的殺傷實驗(4-h AST釋放實驗)進一步證明低劑量Con A活化的NK細胞對肝細胞的細胞毒作用依賴于NK細胞與肝細胞之間NKG2D-ligand相互識別。 另外，在低劑量Con A誘導HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟敏感損傷過程中，活化的NKT細胞通過分泌細胞因子IFN-γ和IL-4對NK細胞活化發(fā)揮重要的正向調(diào)節(jié)作用。 5．HBV下調(diào)人肝癌細胞系MHC-Ⅰ類分子的表達 利用轉(zhuǎn)染HBV的HepG2．2．15細胞系及其對照細胞系HepG2，發(fā)現(xiàn)HBV感染顯著抑制肝癌細胞表面HLA-ABC分子的表達，HLA-E mRNA的表達；顯著下調(diào)肝癌細胞膜型MICA分子及MICA mRNA的表達。 本研究首次揭示了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞的特性及HBV感染肝臟免疫損傷高度敏感的天然免疫機制，同時對HBV感染對人肝細胞MHC-Ⅰ類分子表達的影響進行了初步的探討。本研究將為揭示人類HBV慢性攜帶者肝臟NK細胞的基本特性及肝細胞損傷敏感性增加的免疫學機理提供重要依據(jù)，對控制、治療HBV慢性感染導致的多種肝臟疾病具有一定的指導意義。
【圖文】：

圖3.機體抗RBV感染的免疫應答機制四、肝臟天然免疫系統(tǒng)在HBV轉(zhuǎn)基因動物模型及自身免疫性肝炎模型中的作用由于HBV只感染人和猩猩，故對HBV感染及其致病機理的研究受到很大的限制，尤其是對肝臟微環(huán)境及肝臟內(nèi)免疫應答的研究。轉(zhuǎn)基因小鼠的問世從一定程度上解決了這一難題，為研究HBV感染及其致病機理提供了很好的動物模型。HBVDNA負鏈有四個開放區(qū)，分別稱為S、C、P及X，能編碼全部已知的HBV蛋白質(zhì)。S區(qū)可分為兩部分:S基因和前S基因，分別編碼主要表面蛋白，Presl和Pre52蛋白;C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼HBeAg和HBcAg:P區(qū)最長，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶:x區(qū)編碼堿性多膚。研究者利用胚胎顯微注射的方法將HBV全基因或部分基因(s基因、

中國科學技術(shù)大學博士學位論文正常野生型小鼠相比，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細胞中CD69由3785%下降至21.09%(圖ZA)，統(tǒng)計分析結(jié)果表明HBV轉(zhuǎn)細胞的CD69表達水平(19.74土2.9)%明顯低于正常野生型小%(圖ZB)。而脾臟及外周血中NK細胞的CD69表達水平在H與正常野生型小鼠之間沒有明顯差異。
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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7 湖南省腫瘤醫(yī)院主任醫(yī)師 劉保安;癌癥能傳染嗎？[N];大眾衛(wèi)生報;2000年

8 ;乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播與人類白細胞抗原－DR區(qū)域基因相關(guān)性的研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

9 ;乙型肝炎病毒x蛋白對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響[N];中國醫(yī)藥報;2003年

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本文編號：2548990