【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)作為一種非細(xì)胞毒性的嗜肝病毒，感染機(jī)體后將導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等一系列肝臟疾病的發(fā)生，成為危害人類健康的一項(xiàng)嚴(yán)重問題。機(jī)體對病毒抗原的免疫反應(yīng)是HBV引起肝臟疾病的重要機(jī)制，但目前HBV確切的致病機(jī)理仍不清楚。隨著肝臟天然免疫系統(tǒng)的提出，肝臟內(nèi)天然免疫細(xì)胞在HBV感染致病過程中的作用引起了學(xué)者們的重視，尤其是肝臟NK細(xì)胞。肝臟內(nèi)聚集著大量的NK細(xì)胞，約占肝臟淋巴細(xì)胞總數(shù)的35％。NK細(xì)胞在機(jī)體抗HBV感染中起著不可忽視的作用，但是在HBV感染肝臟免疫致病過程中的作用及其可能的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。值得注意的是人類HBV健康攜帶者再受到外界因素如病毒、細(xì)菌等感染、化學(xué)物質(zhì)、細(xì)胞刺激劑、妊娠及免疫治療等作用后肝細(xì)胞極易發(fā)生損傷，嚴(yán)重危害這一人群的健康。有研究提示NK細(xì)胞參與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟易損傷過程，但是NK細(xì)胞通過何種機(jī)制參與肝細(xì)胞敏感損傷尚未闡明。 故本研究利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL／6J-TgN(AlblHBV)44Bri，一種模擬人類HBsAg健康攜帶者的模型，深入探討肝臟天然免疫細(xì)胞在HBV感染肝臟免疫損傷中的作用及機(jī)理。首先分析比較HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中樞及外周免疫系統(tǒng)中各類淋巴細(xì)胞的存在狀態(tài)，尤其是肝臟NK細(xì)胞的基本特性；利用多種刺激劑如Poly I：C，Con A及CCl_4研究HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷情況，并進(jìn)一步探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答特性及在肝臟損傷中的作用。實(shí)驗(yàn)過程中，采用賴氏法檢測血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST水平、組織H-E染色觀察肝臟病理學(xué)變化，并利用上述指標(biāo)綜合評估肝細(xì)胞損傷程度；通過細(xì)胞清除和細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸技術(shù)，研究特定淋巴細(xì)胞群在肝臟損傷過程中的作用以及細(xì)胞間相互作用關(guān)系；采用流式細(xì)胞術(shù)測定各淋巴細(xì)胞亞群的表型，活化狀態(tài)以及細(xì)胞因子分泌功能；利用Western blotting方法檢測肝細(xì)胞胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；運(yùn)用特異抗體中和實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞間相互作用的分子機(jī)制；運(yùn)用特異性抗體阻斷實(shí)驗(yàn)以及體外AST釋放實(shí)驗(yàn)探索淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞間相互作用機(jī)制。通過上述研究方案獲得如下結(jié)果： 1．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞特性改變 與正常野生型小鼠相比，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少；自然活化程度(CD69表達(dá)水平)明顯下降；對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯受損；表面TRAIL分子的表達(dá)水平明顯下降。而且，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞對Poly I：C的免疫應(yīng)答不同于正常野生型小鼠。雖然Poly I：C能夠刺激HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞的聚集、活化、并提高其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但是HBV轉(zhuǎn)基因小鼠活化的肝臟NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性仍明顯低于正常野生型小鼠。 2．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟損傷敏感性明顯增加 低劑量Poly I：C(3μg／g body weight)誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST急劇升高，嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死和肝臟炎性浸潤，與高劑量Poly I：C(30μg／g body weight)的作用基本相同；而在正常野生型小鼠，僅高劑量Poly I：C的作用引起血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST的輕度上升。 低劑量Con A(3μg／g body weight)刺激下，正常野生型小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST仍在正常范圍內(nèi)；而HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST急劇升高，肝臟有明顯的大片壞死灶及炎性浸潤。足劑量Con A(15μg／g body weight)作用后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠死亡率明顯高于正常野生型小鼠。 另外，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對于化學(xué)毒物CCl_4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷敏感性也顯著增加。刺激24h后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT急劇上升，顯著高于正常野生型小鼠。 3．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對Poly I：C誘導(dǎo)的肝臟損傷敏感性增加的機(jī)制：NK細(xì)胞及IFN-γ依賴途徑 細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)表明HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，低劑量Poly I：C(3μg／g body weight)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞敏感損傷依賴于NK細(xì)胞。低劑量Poly I：C刺激后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)活化的NK細(xì)胞分泌大量IFN-γ。中和體內(nèi)IFN-γ后，低劑量Poly I：C誘導(dǎo)的肝臟敏感損傷明顯減弱。給予外源性重組IFN-γ后血清轉(zhuǎn)氨酶ALT／AST水平表明HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對IFN-γ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷作用更為敏感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞表面IFN-γ受體的表達(dá)水平明顯高于正常野生型小鼠，而且低劑量Poly I：C刺激明顯提高其表達(dá)。在IFN-γ刺激后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞胞內(nèi)信號pSTAT1-IRF-1明顯強(qiáng)于正常野生型小鼠肝細(xì)胞。 另外，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠Poly I：C誘導(dǎo)的肝臟敏感損傷過程中，，NK細(xì)胞發(fā)揮作用不依賴于Kupffer細(xì)胞及IL-12。 4．HBV轉(zhuǎn)基因小鼠對Con A誘導(dǎo)肝臟損傷極度敏感的機(jī)制：NKG2D依賴途徑 細(xì)胞轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)證明在低劑量Con A(3μg／g body weight)誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷過程中，與正常野生型小鼠相比HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟淋巴細(xì)胞對肝細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)，同時(shí)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞對淋巴細(xì)胞的殺傷作用更為敏感。低劑量ConA作用下，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)聚集著更多的活化NK細(xì)胞，而且低劑量Con A誘導(dǎo)的肝臟敏感損傷依賴于NK細(xì)胞。純化的NK細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)證明低劑量Con A活化的肝臟NK細(xì)胞具有肝細(xì)胞毒活性，是肝細(xì)胞損傷的效應(yīng)細(xì)胞。 Con A刺激后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞不同于正常野生型小鼠肝細(xì)胞，其NKG2D配體(Rae-1和Mult-1)的表達(dá)明顯上調(diào)。阻斷HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D通路后，低劑量Con A誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷明顯減弱。體外純化的NK細(xì)胞對肝細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)(4-h AST釋放實(shí)驗(yàn))進(jìn)一步證明低劑量Con A活化的NK細(xì)胞對肝細(xì)胞的細(xì)胞毒作用依賴于NK細(xì)胞與肝細(xì)胞之間NKG2D-ligand相互識別。 另外，在低劑量Con A誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟敏感損傷過程中，活化的NKT細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4對NK細(xì)胞活化發(fā)揮重要的正向調(diào)節(jié)作用。 5．HBV下調(diào)人肝癌細(xì)胞系MHC-Ⅰ類分子的表達(dá) 利用轉(zhuǎn)染HBV的HepG2．2．15細(xì)胞系及其對照細(xì)胞系HepG2，發(fā)現(xiàn)HBV感染顯著抑制肝癌細(xì)胞表面HLA-ABC分子的表達(dá)，HLA-E mRNA的表達(dá)；顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞膜型MICA分子及MICA mRNA的表達(dá)。 本研究首次揭示了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞的特性及HBV感染肝臟免疫損傷高度敏感的天然免疫機(jī)制，同時(shí)對HBV感染對人肝細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子表達(dá)的影響進(jìn)行了初步的探討。本研究將為揭示人類HBV慢性攜帶者肝臟NK細(xì)胞的基本特性及肝細(xì)胞損傷敏感性增加的免疫學(xué)機(jī)理提供重要依據(jù)，對控制、治療HBV慢性感染導(dǎo)致的多種肝臟疾病具有一定的指導(dǎo)意義。
【圖文】：

圖3.機(jī)體抗RBV感染的免疫應(yīng)答機(jī)制四、肝臟天然免疫系統(tǒng)在HBV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及自身免疫性肝炎模型中的作用由于HBV只感染人和猩猩，故對HBV感染及其致病機(jī)理的研究受到很大的限制，尤其是對肝臟微環(huán)境及肝臟內(nèi)免疫應(yīng)答的研究。轉(zhuǎn)基因小鼠的問世從一定程度上解決了這一難題，為研究HBV感染及其致病機(jī)理提供了很好的動(dòng)物模型。HBVDNA負(fù)鏈有四個(gè)開放區(qū)，分別稱為S、C、P及X，能編碼全部已知的HBV蛋白質(zhì)。S區(qū)可分為兩部分:S基因和前S基因，分別編碼主要表面蛋白，Presl和Pre52蛋白;C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼HBeAg和HBcAg:P區(qū)最長，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶:x區(qū)編碼堿性多膚。研究者利用胚胎顯微注射的方法將HBV全基因或部分基因(s基因、

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士學(xué)位論文正常野生型小鼠相比，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞中CD69由3785%下降至21.09%(圖ZA)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明HBV轉(zhuǎn)細(xì)胞的CD69表達(dá)水平(19.74土2.9)%明顯低于正常野生型小%(圖ZB)。而脾臟及外周血中NK細(xì)胞的CD69表達(dá)水平在H與正常野生型小鼠之間沒有明顯差異。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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本文編號：2548990