【摘要】：分子量為65KD的卡介苗熱休克蛋白(BCG HSP65)具有分子伴侶功能。在免疫應(yīng)答過程中,HSP65與腫瘤表位抗原形成的融合蛋白,通過受體介導(dǎo)進(jìn)入樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC),HSP65協(xié)助與之融合的抗原,進(jìn)入MHC I類加工途徑并遞呈在細(xì)胞表面,從而激活抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)的免疫反應(yīng)。 本研究針對(duì)前列腺癌腫瘤相關(guān)抗原(PSA)的表位抗原,設(shè)計(jì)并制備了HSP65融合蛋白疫苗,擬將其研制成一種能誘導(dǎo)產(chǎn)生PSA特異性CTL的前列腺癌的預(yù)防性或治療性疫苗。我們將編碼分支桿菌熱休克蛋白65基因與多個(gè)PSA表位基因進(jìn)行融合,在大腸桿菌中表達(dá)多表位融合蛋白(HSP65-PSA)。首先我們構(gòu)建了表達(dá)人PSA多表位基因的、來源于C57BL/6小鼠的B16、RM1和EL4三種腫瘤細(xì)胞系。應(yīng)用此三株細(xì)胞在小鼠體內(nèi)進(jìn)行抑瘤的實(shí)驗(yàn)表明:HSP65-PSA能夠誘生小鼠的PSA特異性CTL,對(duì)表達(dá)人PSA的小鼠腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用。體外功能實(shí)驗(yàn)表明:用HSP65-PSA裝載人DC的HSP65-PSA誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL,能夠殺傷裝載HLA-A2限制性PSA表位肽的T2靶細(xì)胞。PSA表位肽裝載樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)用于刺激自體naive T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的CTL,能夠殺傷表達(dá)全長PSA蛋白的人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP。 為了研究HSP65-PSA的作用機(jī)理,我們制備了HSP65單克隆抗體和FITC標(biāo)記的HSP65,并研究了人DC可能存在的HSP65受體。結(jié)果表明:人DC表面存在HSP65受體,此受體與CD91分子無相關(guān)性。 以上工作表明,HSP65-PSA重組蛋白可能通過DC的HSP65受體發(fā)揮其抗腫瘤作用,它有希望成為有效的前列腺癌預(yù)防性和治療性疫苗。
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位.2 機(jī)械介導(dǎo)方法提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率建立一個(gè)快速有效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，我們對(duì)傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法過脂質(zhì)體和機(jī)械介導(dǎo)的脂質(zhì)體改良轉(zhuǎn)染方法，將 pCDNA3-GFP-PSA 質(zhì)粒、EL4 和 RM1 細(xì)胞，經(jīng) G418 選擇培養(yǎng) 2 周后，以轉(zhuǎn)染 pCDNA3 的同種小檢測(cè)的陰性對(duì)照，，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖 2）顯示：機(jī)械外力介導(dǎo)達(dá) GFP 的陽性率（26％，24％，40％）明顯高于單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)6％，18％），說明在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程中，增加玻璃滴管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。我們對(duì)改良法獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選，并與染方法在轉(zhuǎn)染流程和克隆篩選周期方面進(jìn)行比較。

吉林大學(xué)博士學(xué)位.3 改良法與傳統(tǒng)法在轉(zhuǎn)染和克隆篩選方面的比較對(duì)比改良法與傳統(tǒng)法在轉(zhuǎn)染和克隆篩選方面的差別，用圖示方法（方法從轉(zhuǎn)染前細(xì)胞準(zhǔn)備到獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的流程。比較結(jié)果顯示：制備細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)不受細(xì)胞密度和生長狀態(tài)影響，細(xì)胞數(shù)可精確定體生化轉(zhuǎn)染過程中，增加簡單的滴管介導(dǎo)的物理轉(zhuǎn)染過程，不需要擇性擴(kuò)增培養(yǎng)和胰酶的消化，直接進(jìn)入克隆化和選擇培養(yǎng)階段。在上，改良法獲得的單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的時(shí)間，至少比傳統(tǒng)法提前 2 由于結(jié)合了脂質(zhì)體的化學(xué)轉(zhuǎn)染和滴管介導(dǎo)的物理轉(zhuǎn)染過程，可獲得率，經(jīng)過克隆篩選后，有更多機(jī)會(huì)獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)染 2 周時(shí)，通過共聚焦顯微鏡觀察，獲得表達(dá)外源報(bào)告蛋白 GFP 的株可進(jìn)入 6 孔培養(yǎng)板擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染 4 周時(shí)，細(xì)胞可進(jìn)行凍存和進(jìn)一步可知：改良法比傳統(tǒng)法具有許多優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2549040