【摘要】： 目前世界上有1.7億人感染丙型肝炎病毒,危害嚴(yán)重,但目前還沒(méi)有特效的治療技術(shù)和方法。找出肝細(xì)胞中與HCV反式調(diào)節(jié)相關(guān)的基因,并進(jìn)一步弄清具體作用機(jī)制、作用效應(yīng)及連帶影響,對(duì)明確HCV的致病機(jī)理,尋找有效防治方法有重要意義。HCV p7TP2是利用基因芯片篩選的HCV p7蛋白下調(diào)表達(dá)的靶基因,其許多功能仍需要進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)主要應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)、抑制性消減雜交技術(shù)、原核表達(dá)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法研究p7TP2基因的生物學(xué)功能。 1.以HepG2細(xì)胞cDNA為模板克隆出p7TP2基因,編碼區(qū)為495bp (核苷酸),應(yīng)用生物信息學(xué)分析此基因位于8q24.3,半衰期為30h,屬于不穩(wěn)定蛋白,疏水指數(shù)較高,預(yù)測(cè)可能為具有不緊密的球蛋白結(jié)構(gòu),具有信號(hào)肽及兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。 2.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證HCV p7蛋白下調(diào)p7TP2基因的表達(dá),并應(yīng)用抑制性消減雜交篩選并構(gòu)建p7TP2下調(diào)表達(dá)基因的消減文庫(kù),同源性分析p7TP2下調(diào)表達(dá)的基因主要位于線(xiàn)粒體,并與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。 3.利用原核表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建融合表達(dá)載體,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,證明其相對(duì)分子量約為33000,純化融合蛋白,并免疫兔子,制備多克隆抗體,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、蛋白質(zhì)免疫印跡,此抗體具有較高效價(jià)和特異性。 4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)p7TP2蛋白在陽(yáng)性組織中分布在細(xì)胞漿,且在正常組織的表達(dá)量比病理組織高。構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與p7TP2的融合基因,轉(zhuǎn)入不同的細(xì)胞系HepG2及COS-7,熒光顯微鏡觀(guān)察其亞細(xì)胞定位,顯示熒光主要集中在細(xì)胞漿。 5.應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng),構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-p7TP2,轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109,并與轉(zhuǎn)化人肝細(xì)胞文庫(kù)質(zhì)粒的酵母細(xì)胞Y187配合,在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和X-α-gal上進(jìn)行雙重篩選,測(cè)序,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示p7TP2蛋白與一些直接和間接與抗凝血因子有關(guān)的蛋白基因具有相互作用,推測(cè)p7TP2蛋白可能直接或間接參與抗凝血過(guò)程。 6.選取p7TP2基因起始密碼子ATG上游1203bp下游147bp的基因組DNA序列作為啟動(dòng)子,克隆并構(gòu)建載體pCAT3-p7TP2-p和PGLB-p7TP2-p,應(yīng)用CAT表達(dá)系統(tǒng)和雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)顯示在不同的細(xì)胞系HepG2和Huh-7中均具有啟動(dòng)子活性;共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)顯示HCV p7對(duì)p7TP2啟動(dòng)子活性具有下調(diào)作用。 上述結(jié)論為進(jìn)一步研究p7TP2基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的線(xiàn)索,也為HCV p7的反式調(diào)節(jié)作用及HCV發(fā)病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

進(jìn)行 PROF 預(yù)測(cè)，并預(yù)測(cè)可能為球蛋白，但結(jié)構(gòu)并不是特別緊密。疏水性預(yù)測(cè)最大值是 2.422，最小值是-2.289，在 8～32，100～118，基酸具有很強(qiáng)的疏水性，其次是 84～95 的區(qū)域具有一定的疏水性(圖gnalP-信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)該蛋白信號(hào)肽概率 0.991，，錨定蛋白概率點(diǎn)概率是 0.471，位于 27 與 28 氨基酸之間(圖 2-7)。進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的分析包括兩個(gè)強(qiáng)跨膜螺旋(從 11~27，跨膜方向由跨膜方向由外向內(nèi))(圖 2-8)，無(wú)明顯的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。1 MVEVPRHHPC CLLMALGWVL PSWGSLGAVG SPESAWRRWR FGEFGRQAGV51 SCRGPGKGDC DSGSSRAKAx xxxxxxxxxx xTPAHCTLRF QLPGAGEMAE101 PGPWMISVPV PLFPGxxxxx xxxxxxxxWR NTGPNRGCGS KTHTRTRPGA151 ALCSSGPWLG LVVM圖 2-5 x 代表低復(fù)雜性區(qū)域Fig.2-5 x represents low reproducibility regions

圖 2-7 p7TP2 蛋白的信號(hào)肽分析Fig.2-7 the signal peptide analysis of p7TP2 protein圖 2-8 p7TP2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2-8 the transmembrane structural domain analysis of p7TP2 protein
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2547428