【摘要】：受體NKG2D屬C型凝集素家族跨膜蛋白，廣泛表達在NK細胞、CD8~+的αβT細胞和γδT細胞表面。MHC-I類鏈相關(guān)分子A(MHC class I chain-related molecules A, MICA)是人類NKG2D識別的配體之一，應(yīng)激性表達在一些腫瘤細胞或病原體感染細胞的表面，MICA的可溶性表達可能是導(dǎo)致這些腫瘤細胞“免疫逃逸”的重要原因之一。NKG2D-配體(NKG2DL)產(chǎn)生的活化信號既能直接活化NK細胞，又能以協(xié)同刺激的方式促進CD8~+αβT胞的活化。然而，NKG2DL刺激γδT細胞活化的方式目前存在爭議。人類γδT細胞主要包括兩個亞群：分布在外周血中的Vγ9／δ2T細胞和分布于粘膜上皮組織的Vδ1T細胞，Vγ9／δ2T細胞抗原識別受體(T cell receptor, TCR)可識別小分子磷酸化抗原，Vδ1TCR可識別應(yīng)激性分子MICA／MICB。 為了研究MICA-NKG2D相互作用在Vγ9／δ2T細胞和Vδ1T細胞活化和效應(yīng)中的作用機制，我們進行了以下研究：1、從人類外周血中成功克隆了NKG2D的cDNA，并利用pET原核表達系統(tǒng)表達了人NKG2D分子胞外區(qū)(80～216氨基酸)的重組蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后獲得了高純度的人rNKG2D蛋白。2、用雜交瘤技術(shù)制備rNKG2D分子的單克隆抗體。3、用固相化anti-pan-γδTCR單抗擴增人PBMC，得到純度達90％以上Vγ9／δ2T細胞；用固相化rMICA蛋白擴增卵巢癌(OEC)患者腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，獲得純度為68％的Vδ1T細胞。4、檢測anti-NKG2D單抗或rMICA蛋白封閉前后，vγ9／δ2T細胞和Vδ1T細胞對Daudi、HCT-116和HT-29腫瘤細胞的殺傷活性。在效靶比10：1時，anti-NKG2D單抗對Vγ9／δ2T細胞殺傷HCT-116和HT-29細胞的阻斷率分別為20％和10％，而rMICA蛋白的阻斷效率分別為12％和5％；在相同效靶比下，anti-NKG2D單抗對Vδ1T細胞殺傷HCT-116和HT-29細胞的阻斷率分別為42％和35％，rMICA蛋白的阻斷率分別為18％和20％。5、構(gòu)建表達不同形式MICA分子和eGFP融合蛋白的真核表達體系，瞬時轉(zhuǎn)染MICA~-的CHO細胞和Daudi細胞，檢測γδT細胞對表達不同形式MICA分子靶細胞的殺傷效率。
【圖文】：

.7BL21(DE3)IPET22b一NKGZD表達產(chǎn)物的SDS一EanalysisofexPerssionPorduCtsofBL21(DE3)IPEd:LnaeZ:PereiPiatte，uninduced:Lnae4:10wmolecolL/尿素變性后，經(jīng)HisTarpkit親和柱純果如圖1.8所示，獲得較高純度的目的蛋白單克隆抗體(克隆號為1D11)為一抗，以H體反應(yīng)，再于暗室中經(jīng)壓片、曝光、顯色后，，如圖1.9所示，叭觸setm一blot結(jié)果證實原抗IDll結(jié)合。

sPuenraatnt，induced.包涵體經(jīng)smolL/尿素變性后，經(jīng)HisTarpkit親和柱純化后，透析復(fù)性，SDS一APGE鑒定結(jié)果如圖1.8所示，獲得較高純度的目的蛋白。電泳后轉(zhuǎn)膜，以市售的抗NKGZD單克隆抗體(克隆號為1D11)為一抗，以HRP一羊抗鼠gIG為二抗，進行抗原抗體反應(yīng)，，再于暗室中經(jīng)壓片、曝光、顯色后，在目的蛋白對應(yīng)分子量處出現(xiàn)條帶，如圖1.9所示，叭觸setm一blot結(jié)果證實原核表達的NrKGZD蛋白能與特異性單抗IDll結(jié)合。圖1.8重組NKGZO蛋白純化產(chǎn)物的505一APGE分析
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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1 臧怡雯;周易明;陳宗yP;;NKG2D及其配體在腫瘤免疫中的研究進展[J];復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年04期

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李建強;MICA-NKG2D相互作用活化γδT細胞的機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

本文編號：2546847