【摘要】： 前言 移植免疫排斥問題始終是困擾器官移植界及免疫學界的一個難題。免疫抑制劑的應用帶來一系列問題，如感染、腫瘤高發(fā)等。通過各種手段使患者擺脫移植后的長期藥物的依賴，免除免疫抑制劑的使用或最大程度地減少藥物的劑量，達到移植物與受者的長期良好存活，是移植領域的最終目標。細胞遷移過程是研究器官移植免疫反應的一個重要課題。近年來趨化因子在細胞遷移過程中的作用得到了充分的重視，認為淋巴細胞的遷移在很大程度上受到趨化因子的影響。 目前淋巴細胞向二級淋巴器官的遷移過程已經(jīng)被逐漸闡明，這是一個多步驟的聯(lián)級反應，受到多種因子的調控。其中淋巴細胞表面的CCR7與配體CCL19、CCL21的相互作用起到極為重要的作用，是淋巴細胞進入淋巴結的關鍵。在二級淋巴器官內(nèi)部，CCR7與CCL19的作用繼續(xù)維持淋巴細胞的游走。另外樹突狀細胞的遷移也受CCR7及配體作用的調控。CCR7基因敲除小鼠(CCR7~(-／-))是由德國的F(?)rster教授于1999年制備成功，CCRT~(-／-)小鼠最大的特征是由于CCR7的缺失，導致淋巴細胞遷移功能的損害，使其向二級淋巴組織歸巢的過程受阻。 最初的研究表明，受者的二級淋巴器官在免疫排斥反應中是必需的。Lakkis等的實驗發(fā)現(xiàn)缺乏二級淋巴器官的aly／aly小鼠無法排斥同種異體的心臟移植物。但是最近Zhou等在另兩種淋巴結缺失的LTα~(-／-)和LTβR~(-／)小鼠中卻發(fā)現(xiàn)，雖然異體心臟與皮膚移植物在這兩種受者中存活時間明顯延長，但是卻并未達成耐受狀態(tài)。另外，plt／plt小鼠是缺乏CCR7配體CCL19與CCL21的基因敲除小鼠，其二級淋巴器官也是空虛的。移植結果同樣表明，心臟移植物的存活時間得以有限延長，但耐受狀態(tài)卻并不存在。上述結果均提示了二級淋巴器官在移植排斥過程中并非必須，但這些研究均是在二級淋巴器官缺失的基因敲除小鼠中進行，尚少見在淋巴細胞遷移受體缺失的受者中進行的研究。如CCR7~(-／-)小鼠，其淋巴細胞與樹突狀細胞因缺乏CCR7而無法遷移至淋巴結內(nèi)，僅能在外周組織中循環(huán)，其效應與淋巴器官缺失是類似的。 因此，本研究是在CCR7~(-／-)小鼠基礎上進行一系列的移植研究實驗，總體而言分為四個方面的探索：一、以CCR7~(-／-)小鼠作為受者，研究淋巴細胞遷移障礙的受者對同種異體移植物的排斥情況及耐受狀態(tài)是否達成。二、以CCR7~(-／-)小鼠作為供者，其供者器官內(nèi)的樹突狀細胞無法游走遷移到受者的二級淋巴器官，從而在理論上無法遞呈供者抗原，以研究這一狀態(tài)下的器官移植排斥狀態(tài)。三、以CCR7~(-／-)小鼠分別作供受者，以研究這兩種效應結合對移植物存活與排斥反應的影響。四、采用經(jīng)典的免疫誘導方案研究CCR7的缺失對移植免疫耐受狀態(tài)的影響。 小腸移植(small bowel transplantation，SBTx)是治療不可逆小腸功能衰竭的有效手段，由于小腸的免疫原性很高，且富含淋巴組織及腸道菌群，可以導致很難控制的排斥反應。與其他的實質性器官移植相比較，臨床小腸移植依然未取得滿意的結果。因此，迫切需要尋求一種高效、低毒、高度特異性的治療方案，以減少小腸移植的排斥反應。 FTY720是一種新型免疫調節(jié)劑，其作用是可以促進外周淋巴細胞進入二級淋巴器官，從而導致外周血中淋巴細胞減少，起到免疫調節(jié)作用。FTY720的藥物特性，使促進淋巴細胞遷移的手段應用于免疫耐受的誘導與調節(jié)成為可能。共刺激通道阻斷劑是廣泛使用的免疫耐受手段，其中CD40-CD40L(MR1為抗小鼠CD40L單抗)通道阻斷是最為常用與最為有效的方法。在一系列的小鼠移植模型中，MR1聯(lián)合DST均能有效地誘導免疫耐受，但是在小鼠的SBTx中，小腸移植物的存活均未得到改善。 CD40-CD40L共刺激通道阻斷方案誘導免疫耐受的依賴于T淋巴細胞進入到二級淋巴器官。我們在成功建立小鼠小腸移植模型的基礎上，試圖驗證這樣的假設：運用FTY720促進T淋巴細胞進入二級淋巴器官，并延長其滯留時間，同時聯(lián)合CD40-CD40L共刺激通道阻斷，以增強誘導小腸移植物免疫耐受的效果。 材料與方法 第一部分：趨化因子受體CCR7缺失對同種異體移植免疫反應的影響 1．實驗動物分組：分別以CCR7~(-／-)小鼠作為移植供者或受者，以及CCR7~(-／-)小鼠同時作為供受者進行同種異體移植。 2．小鼠心臟移植采用腹部異位移植方法。 3．小鼠皮膚移植采用背部移植方法。 4．小鼠心臟移植物病理組織學分析包括光鏡下HE染色，CD4與CD8免疫組織化學染色。 5．受者小鼠局部引流淋巴結內(nèi)的淋巴細胞表型分析，采用流式細胞法，通過CD4、CD8、B220染色并計數(shù)。 第二部分：FTY720聯(lián)合共刺激通道阻斷抑制小鼠小腸移植的排斥反應 1．實驗動物分組：供者小鼠為C3H小鼠(H-2~k)，受者小鼠為C57BL／6小鼠(H-2~b)。分為空白對照組，MR1單獨治療組，F(xiàn)TY720單獨治療組，F(xiàn)TY720與MR1聯(lián)合治療組。MR1在術后當天給予靜脈注射500μg，相同劑量的藥物在術后d2、4、7經(jīng)腹腔注射給藥；FTY720每日按1mg／kg劑量灌胃。 2．小鼠小腸移植采用腹部異位移植方法，遠端與受者小腸吻合。 3．移植物病理組織學評估采用移植后6d與14d，分別取移植腸HE染色，光鏡下觀測移植物形態(tài)并行移植物排斥評分。 4．小腸移植物各部分淋巴細胞的分離，包括IELs，LPLs，MLNs及PPs，采用膠原酶A消化，EDTA解離及密度梯度離心法。 5．流式細胞分析采用分離獲得的淋巴細胞，分別經(jīng)大鼠抗小鼠CD4、CD8、CD19、CD69、CD25單抗孵育染色，流式細胞儀上機讀取結果并分析。 6．多重免疫熒光染色分別由H2-Kb，，CD3，B220單抗孵育染色，在熒光顯微鏡下讀片并進行圖像合成。 結果 第一部分：趨化因子受體CCR7缺失對同種異體移植免疫反應的影響 1．同種異體皮膚及心臟移植物在CCR7~(-／-)小鼠中存活時間延長。 2．移植物的病理學分析發(fā)現(xiàn)CCR7~(-／-)小鼠的心臟移植物中浸潤的單核細胞明顯減少。 3．流式細胞分析結果表明CCR7~(-／-)小鼠中移植物局部引流淋巴結的T細胞與B細胞的增殖速度與數(shù)量明顯小于野生型小鼠。 4．CCR7~(-／-)供者移植物在野生型受者中的存活時間無明顯延長。供受者均為CCR7~(-／-)小鼠，也未達成免疫耐受。 5．小劑量CsA治療對CCR7~(-／-)小鼠并無協(xié)同作用，反而消除了后者心臟移植排斥的延緩作用。 6．CCR7~(-／-)小鼠行脾切除對移植物無保護作用。 7．經(jīng)典的耐受誘導方案CD40-CD40L通道阻斷聯(lián)合DST在CCR7~(-／-)小鼠中無法誘導心臟移植物免疫耐受。 第二部分：FTY720聯(lián)合共刺激通道阻斷抑制小鼠小腸移植的排斥反應 1．小鼠小腸移植模型成功建立，手術成功率90％以上。 2．FTY720與MR1聯(lián)合治療對小鼠小腸移植排斥反應有明顯的抑制作用，但FTY720與MR1的單獨治療均無效果。 3．FTY720與MR1聯(lián)合治療顯著減少受者外周淋巴細胞數(shù)量。 4．FTY720減少移植物MLNs和PPs中受者CD4~+淋巴細胞的數(shù)量，但不影響CD8~+淋巴細胞。 5．FTY720和MR1聯(lián)合治療明顯抑制CD8~+淋巴細胞在移植物LPLs中的浸潤。 6．FTY720和MR1聯(lián)合治療抑制移植物內(nèi)宿主淋巴細胞的活性，CD44陽性細胞明顯減少。 7．FTY720抑制小鼠小腸移植物內(nèi)的CD11b~+Gr1~+單核細胞的浸潤。 結論 1、同種異體移植物在CCR7缺失的受者中存活時間延長，仍可引起免疫排斥反應。經(jīng)典的免疫耐受方案無法在CCR7缺失的小鼠中誘導移植耐受。 2、FTY720聯(lián)合CD40-CDC0L共刺激通道阻斷可以有效抑制小鼠小腸同種異體移植物的排斥反應。機制可能是通過減少受者淋巴細胞向移植物浸潤并抑制其激活，尤其減少受者CD8~+淋巴細胞向移植物固有層的浸潤。
【圖文】：

川10二.一.…‘-.燈.姻日豪扣z一‘.、二，，嘆..…從。g吐;.矛‘·言::’:，i.，八‘ti切 atedTeells圖1(l)在ccR7一人小鼠中，受者T淋巴細胞無法進入二級淋巴器官，因此無法與供者的Dc在淋巴結內(nèi)相互作用，可能影響移植杭原的提呈.(2)在ccR7不的供者器官中，供者Dc遷移功能受領，因此無法進入受者二級淋巴器官，可能影響移植抗原的提呈。(l)與(2)在供受者均為ccR7一J.鼠時，供者Dc與受者T淋巴細胞均不能進入二級淋巴器官，因此可能進一步影響材料與方法一、實驗動物與分組C3H小鼠(H一Zk)

ccRv-/一受者的心臟移植物內(nèi)cD4+與cDS十陽性淋巴細少于野生型受體，但移植后6d，上述細胞的浸潤情況無差異。(*CCR7一小鼠皮膚移植物局部引流淋巴結內(nèi)的細胞增殖反應為了進一步明確在CCR7子小鼠中皮膚移植物排斥減緩的機制，我們移植物局部引流淋巴結內(nèi)的淋巴細胞的增殖反應。在CCR7一小鼠的植C3H的皮膚后4d與7d，我們獲取其局部引流淋巴結進行流式細胞表明ccR7一小鼠中局部的T細胞與B細胞的增殖速度與數(shù)量明顯小但淋巴細胞激活標記CD25并未有顯著變化。在野生型小鼠，甚至膚移植也可激發(fā)局部淋巴結內(nèi)細胞的快速增殖，而CCR7一人小鼠中，細胞擴增數(shù)量明顯減少，與排斥減緩現(xiàn)象一致。見圖6。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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