【摘要】： 前言 移植免疫排斥問題始終是困擾器官移植界及免疫學(xué)界的一個(gè)難題。免疫抑制劑的應(yīng)用帶來一系列問題，如感染、腫瘤高發(fā)等。通過各種手段使患者擺脫移植后的長(zhǎng)期藥物的依賴，免除免疫抑制劑的使用或最大程度地減少藥物的劑量，達(dá)到移植物與受者的長(zhǎng)期良好存活，是移植領(lǐng)域的最終目標(biāo)。細(xì)胞遷移過程是研究器官移植免疫反應(yīng)的一個(gè)重要課題。近年來趨化因子在細(xì)胞遷移過程中的作用得到了充分的重視，認(rèn)為淋巴細(xì)胞的遷移在很大程度上受到趨化因子的影響。 目前淋巴細(xì)胞向二級(jí)淋巴器官的遷移過程已經(jīng)被逐漸闡明，這是一個(gè)多步驟的聯(lián)級(jí)反應(yīng)，受到多種因子的調(diào)控。其中淋巴細(xì)胞表面的CCR7與配體CCL19、CCL21的相互作用起到極為重要的作用，是淋巴細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)的關(guān)鍵。在二級(jí)淋巴器官內(nèi)部，CCR7與CCL19的作用繼續(xù)維持淋巴細(xì)胞的游走。另外樹突狀細(xì)胞的遷移也受CCR7及配體作用的調(diào)控。CCR7基因敲除小鼠(CCR7~(-／-))是由德國(guó)的F(?)rster教授于1999年制備成功，CCRT~(-／-)小鼠最大的特征是由于CCR7的缺失，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞遷移功能的損害，使其向二級(jí)淋巴組織歸巢的過程受阻。 最初的研究表明，受者的二級(jí)淋巴器官在免疫排斥反應(yīng)中是必需的。Lakkis等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺乏二級(jí)淋巴器官的aly／aly小鼠無法排斥同種異體的心臟移植物。但是最近Zhou等在另兩種淋巴結(jié)缺失的LTα~(-／-)和LTβR~(-／)小鼠中卻發(fā)現(xiàn)，雖然異體心臟與皮膚移植物在這兩種受者中存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但是卻并未達(dá)成耐受狀態(tài)。另外，plt／plt小鼠是缺乏CCR7配體CCL19與CCL21的基因敲除小鼠，其二級(jí)淋巴器官也是空虛的。移植結(jié)果同樣表明，心臟移植物的存活時(shí)間得以有限延長(zhǎng)，但耐受狀態(tài)卻并不存在。上述結(jié)果均提示了二級(jí)淋巴器官在移植排斥過程中并非必須，但這些研究均是在二級(jí)淋巴器官缺失的基因敲除小鼠中進(jìn)行，尚少見在淋巴細(xì)胞遷移受體缺失的受者中進(jìn)行的研究。如CCR7~(-／-)小鼠，其淋巴細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞因缺乏CCR7而無法遷移至淋巴結(jié)內(nèi)，僅能在外周組織中循環(huán)，其效應(yīng)與淋巴器官缺失是類似的。 因此，本研究是在CCR7~(-／-)小鼠基礎(chǔ)上進(jìn)行一系列的移植研究實(shí)驗(yàn)，總體而言分為四個(gè)方面的探索：一、以CCR7~(-／-)小鼠作為受者，研究淋巴細(xì)胞遷移障礙的受者對(duì)同種異體移植物的排斥情況及耐受狀態(tài)是否達(dá)成。二、以CCR7~(-／-)小鼠作為供者，其供者器官內(nèi)的樹突狀細(xì)胞無法游走遷移到受者的二級(jí)淋巴器官，從而在理論上無法遞呈供者抗原，以研究這一狀態(tài)下的器官移植排斥狀態(tài)。三、以CCR7~(-／-)小鼠分別作供受者，以研究這兩種效應(yīng)結(jié)合對(duì)移植物存活與排斥反應(yīng)的影響。四、采用經(jīng)典的免疫誘導(dǎo)方案研究CCR7的缺失對(duì)移植免疫耐受狀態(tài)的影響。 小腸移植(small bowel transplantation，SBTx)是治療不可逆小腸功能衰竭的有效手段，由于小腸的免疫原性很高，且富含淋巴組織及腸道菌群，可以導(dǎo)致很難控制的排斥反應(yīng)。與其他的實(shí)質(zhì)性器官移植相比較，臨床小腸移植依然未取得滿意的結(jié)果。因此，迫切需要尋求一種高效、低毒、高度特異性的治療方案，以減少小腸移植的排斥反應(yīng)。 FTY720是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，其作用是可以促進(jìn)外周淋巴細(xì)胞進(jìn)入二級(jí)淋巴器官，從而導(dǎo)致外周血中淋巴細(xì)胞減少，起到免疫調(diào)節(jié)作用。FTY720的藥物特性，使促進(jìn)淋巴細(xì)胞遷移的手段應(yīng)用于免疫耐受的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)成為可能。共刺激通道阻斷劑是廣泛使用的免疫耐受手段，其中CD40-CD40L(MR1為抗小鼠CD40L單抗)通道阻斷是最為常用與最為有效的方法。在一系列的小鼠移植模型中，MR1聯(lián)合DST均能有效地誘導(dǎo)免疫耐受，但是在小鼠的SBTx中，小腸移植物的存活均未得到改善。 CD40-CD40L共刺激通道阻斷方案誘導(dǎo)免疫耐受的依賴于T淋巴細(xì)胞進(jìn)入到二級(jí)淋巴器官。我們?cè)诔晒⑿∈笮∧c移植模型的基礎(chǔ)上，試圖驗(yàn)證這樣的假設(shè)：運(yùn)用FTY720促進(jìn)T淋巴細(xì)胞進(jìn)入二級(jí)淋巴器官，并延長(zhǎng)其滯留時(shí)間，同時(shí)聯(lián)合CD40-CD40L共刺激通道阻斷，以增強(qiáng)誘導(dǎo)小腸移植物免疫耐受的效果。 材料與方法 第一部分：趨化因子受體CCR7缺失對(duì)同種異體移植免疫反應(yīng)的影響 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：分別以CCR7~(-／-)小鼠作為移植供者或受者，以及CCR7~(-／-)小鼠同時(shí)作為供受者進(jìn)行同種異體移植。 2．小鼠心臟移植采用腹部異位移植方法。 3．小鼠皮膚移植采用背部移植方法。 4．小鼠心臟移植物病理組織學(xué)分析包括光鏡下HE染色，CD4與CD8免疫組織化學(xué)染色。 5．受者小鼠局部引流淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞表型分析，采用流式細(xì)胞法，通過CD4、CD8、B220染色并計(jì)數(shù)。 第二部分：FTY720聯(lián)合共刺激通道阻斷抑制小鼠小腸移植的排斥反應(yīng) 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：供者小鼠為C3H小鼠(H-2~k)，受者小鼠為C57BL／6小鼠(H-2~b)。分為空白對(duì)照組，MR1單獨(dú)治療組，F(xiàn)TY720單獨(dú)治療組，F(xiàn)TY720與MR1聯(lián)合治療組。MR1在術(shù)后當(dāng)天給予靜脈注射500μg，相同劑量的藥物在術(shù)后d2、4、7經(jīng)腹腔注射給藥；FTY720每日按1mg／kg劑量灌胃。 2．小鼠小腸移植采用腹部異位移植方法，遠(yuǎn)端與受者小腸吻合。 3．移植物病理組織學(xué)評(píng)估采用移植后6d與14d，分別取移植腸HE染色，光鏡下觀測(cè)移植物形態(tài)并行移植物排斥評(píng)分。 4．小腸移植物各部分淋巴細(xì)胞的分離，包括IELs，LPLs，MLNs及PPs，采用膠原酶A消化，EDTA解離及密度梯度離心法。 5．流式細(xì)胞分析采用分離獲得的淋巴細(xì)胞，分別經(jīng)大鼠抗小鼠CD4、CD8、CD19、CD69、CD25單抗孵育染色，流式細(xì)胞儀上機(jī)讀取結(jié)果并分析。 6．多重免疫熒光染色分別由H2-Kb，，CD3，B220單抗孵育染色，在熒光顯微鏡下讀片并進(jìn)行圖像合成。 結(jié)果 第一部分：趨化因子受體CCR7缺失對(duì)同種異體移植免疫反應(yīng)的影響 1．同種異體皮膚及心臟移植物在CCR7~(-／-)小鼠中存活時(shí)間延長(zhǎng)。 2．移植物的病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCR7~(-／-)小鼠的心臟移植物中浸潤(rùn)的單核細(xì)胞明顯減少。 3．流式細(xì)胞分析結(jié)果表明CCR7~(-／-)小鼠中移植物局部引流淋巴結(jié)的T細(xì)胞與B細(xì)胞的增殖速度與數(shù)量明顯小于野生型小鼠。 4．CCR7~(-／-)供者移植物在野生型受者中的存活時(shí)間無明顯延長(zhǎng)。供受者均為CCR7~(-／-)小鼠，也未達(dá)成免疫耐受。 5．小劑量CsA治療對(duì)CCR7~(-／-)小鼠并無協(xié)同作用，反而消除了后者心臟移植排斥的延緩作用。 6．CCR7~(-／-)小鼠行脾切除對(duì)移植物無保護(hù)作用。 7．經(jīng)典的耐受誘導(dǎo)方案CD40-CD40L通道阻斷聯(lián)合DST在CCR7~(-／-)小鼠中無法誘導(dǎo)心臟移植物免疫耐受。 第二部分：FTY720聯(lián)合共刺激通道阻斷抑制小鼠小腸移植的排斥反應(yīng) 1．小鼠小腸移植模型成功建立，手術(shù)成功率90％以上。 2．FTY720與MR1聯(lián)合治療對(duì)小鼠小腸移植排斥反應(yīng)有明顯的抑制作用，但FTY720與MR1的單獨(dú)治療均無效果。 3．FTY720與MR1聯(lián)合治療顯著減少受者外周淋巴細(xì)胞數(shù)量。 4．FTY720減少移植物MLNs和PPs中受者CD4~+淋巴細(xì)胞的數(shù)量，但不影響CD8~+淋巴細(xì)胞。 5．FTY720和MR1聯(lián)合治療明顯抑制CD8~+淋巴細(xì)胞在移植物L(fēng)PLs中的浸潤(rùn)。 6．FTY720和MR1聯(lián)合治療抑制移植物內(nèi)宿主淋巴細(xì)胞的活性，CD44陽性細(xì)胞明顯減少。 7．FTY720抑制小鼠小腸移植物內(nèi)的CD11b~+Gr1~+單核細(xì)胞的浸潤(rùn)。 結(jié)論 1、同種異體移植物在CCR7缺失的受者中存活時(shí)間延長(zhǎng)，仍可引起免疫排斥反應(yīng)。經(jīng)典的免疫耐受方案無法在CCR7缺失的小鼠中誘導(dǎo)移植耐受。 2、FTY720聯(lián)合CD40-CDC0L共刺激通道阻斷可以有效抑制小鼠小腸同種異體移植物的排斥反應(yīng)。機(jī)制可能是通過減少受者淋巴細(xì)胞向移植物浸潤(rùn)并抑制其激活，尤其減少受者CD8~+淋巴細(xì)胞向移植物固有層的浸潤(rùn)。
【圖文】：

川10二.一.…‘-.燈.姻日豪扣z一‘.、二，，嘆..…從。g吐;.矛‘·言::’:，i.，八‘ti切 atedTeells圖1(l)在ccR7一人小鼠中，受者T淋巴細(xì)胞無法進(jìn)入二級(jí)淋巴器官，因此無法與供者的Dc在淋巴結(jié)內(nèi)相互作用，可能影響移植杭原的提呈.(2)在ccR7不的供者器官中，供者Dc遷移功能受領(lǐng)，因此無法進(jìn)入受者二級(jí)淋巴器官，可能影響移植抗原的提呈。(l)與(2)在供受者均為ccR7一J.鼠時(shí)，供者Dc與受者T淋巴細(xì)胞均不能進(jìn)入二級(jí)淋巴器官，因此可能進(jìn)一步影響材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組C3H小鼠(H一Zk)

ccRv-/一受者的心臟移植物內(nèi)cD4+與cDS十陽性淋巴細(xì)少于野生型受體，但移植后6d，上述細(xì)胞的浸潤(rùn)情況無差異。(*CCR7一小鼠皮膚移植物局部引流淋巴結(jié)內(nèi)的細(xì)胞增殖反應(yīng)為了進(jìn)一步明確在CCR7子小鼠中皮膚移植物排斥減緩的機(jī)制，我們移植物局部引流淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在CCR7一小鼠的植C3H的皮膚后4d與7d，我們獲取其局部引流淋巴結(jié)進(jìn)行流式細(xì)胞表明ccR7一小鼠中局部的T細(xì)胞與B細(xì)胞的增殖速度與數(shù)量明顯小但淋巴細(xì)胞激活標(biāo)記CD25并未有顯著變化。在野生型小鼠，甚至膚移植也可激發(fā)局部淋巴結(jié)內(nèi)細(xì)胞的快速增殖，而CCR7一人小鼠中，細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量明顯減少，與排斥減緩現(xiàn)象一致。見圖6。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2544588