【摘要】：目的構(gòu)建抗甲胎蛋白(AFP)重鏈可變區(qū)(VH)單域抗體融合蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá),并初步鑒定表達(dá)產(chǎn)物的活性。方法從已構(gòu)建的抗AFP單鏈抗體(ScFv)的載體中,經(jīng)PCR擴(kuò)增出VH單域抗體基因,再克隆到融合蛋白表達(dá)載體pET32a(+)中進(jìn)行表達(dá);用SDS-PAGE及Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物;并通過競爭抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的結(jié)合活性;細(xì)胞免疫組化染色分析其內(nèi)化及結(jié)合情況。結(jié)果VH單域抗體基因全長339 bp,將其克隆到pET32a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得高效表達(dá),Western-blot證實(shí)在相應(yīng)分子質(zhì)量處,有TrxA-VH融合蛋白的顯色條帶。經(jīng)初步純化和復(fù)性后,獲得抗AFP的VH單域抗體融合蛋白。競爭抑制ELISA及細(xì)胞免疫組化證明,表達(dá)產(chǎn)物具有與AFP特異結(jié)合的活性。結(jié)論成功構(gòu)建了抗AFP的V單域抗體融合蛋白,為臨床的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

條分子量約33 kD的新生蛋白帶,與空質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物TrxA蛋白相對分子量(19 kD)和單域抗體相對分子量(14 kD)之和相近(圖1)。252　華西藥學(xué)雜志　　　第22卷

樣品與細(xì)胞共孵育,同樣顯示出陽性,但較A組弱;對照組呈陰性。說明TrxA-VH融合蛋白能夠與AFP結(jié)合,并且具有進(jìn)入胞內(nèi)的能力(圖3)。圖3　免疫組化檢測A、B組和對照組(C)TrxA-VH融合蛋白的結(jié)合及進(jìn)入胞內(nèi)的能力Fig 3　Identification ofTrxA-VHfusion protein ofA group(A), Bgroup(B) and control group(C) by immunocytochem istry1.3.4　單域抗體融合蛋白的Western-blot鑒定　圖4顯示:在相對分子量為33 kD的附近有明顯的誘導(dǎo)條帶生成,雖然Western-blot顯色時有非特異的條帶出現(xiàn),但是33 kD處的條帶最強(qiáng),并且不出現(xiàn)于未誘導(dǎo)的菌體中。說明是與His-tag抗體特異性結(jié)合的VH單域抗體融合蛋白。圖4　TrxA-VH單域抗體融合蛋白的表達(dá)(W estern-blot分析)Fig 4　Identification of expression of TrxA -VHfusion protein byW estern-blot1.3.5　競爭抑制ELISA檢測抗體的活性　將單域抗體融合蛋白依次4倍稀釋,與單克隆抗體通過競爭抑制ELISA來檢測其抑制率,得抑制曲線。由圖5可知,單域抗體滴度為1/64時便可抑制50%的單克隆抗體與抗原結(jié)合。說明抗AFP單域抗體融合蛋白具有良好的抗原結(jié)合能力。圖5　競爭抑制ELISA曲線Fig 5　The curve of competitive inhibition ELISA1·3·6　VH基因的擴(kuò)增　以已構(gòu)建的抗AFP單鏈抗體載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增
【作者單位】： 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室
【基金】：四川大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(No.2004CF09)
【分類號】：R392.12

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：2544337