【摘要】：目的:進行丙型肝炎病毒非結構蛋白3基因真核表達載體的構建,并分析鑒定其在體外培養(yǎng)的人肝細胞QSG7701中的表達。 方法:用PCR方法從含有丙肝病毒全長基因的重組質粒pBRTM/HCV1-3011表達載體中擴增出HCV NS3基因片段,將其與表達載體pcDNA3.1(-)重組,得到重組的真核表達載體pcDNA3.1(-)/NS3。然后采用陽離子多聚體介導法將其轉染人肝細胞QSG7701,以免疫組織化學SP法檢測到細胞中NS3蛋白表達陽性后,即用G418篩選出可穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的系統(tǒng)。對穩(wěn)定表達的細胞提取其細胞質蛋白,用SDS-PAGE電泳及Western Blotting印跡法檢測細胞表達的HCV NS3蛋白。 結果:所得到的NS3片段大小正確,序列正確,并在兩端成功插入起始、終止密碼子和EcoRI、BamHI酶切位點。所構建的真核表達質粒成功轉染QSG7701細胞并可穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白,表達的特異性NS3蛋白分子量為預期的70000。 結論:成功構建了丙型肝炎病毒非結構蛋白3基因的真核表達載體pcDNA3.1(-)/NS3,并且該載體在體外培養(yǎng)的人肝細胞中能穩(wěn)定有效地表達分子量正確的特異性HCV NS3蛋白,從而為進一步研究HCV NS3基因誘發(fā)不死化人肝細胞癌化的機制奠定了基礎。
【圖文】：

peDNA3.(l一)(.54k句質粒圖譜

上游引物:GAAITC戶a，，GGCGCCC戶口，CACGGCGI人CGC，引入了EcO石夢酶切位點和翻譯起始密碼子戶JG。下游引物:CTGGACCTCCAGCAGTGCA門，CCI，AGG，引入了BamHI酶切位點和翻譯終止密碼子戶丁1，。PCR引物由上海生工生物科技公司合成。三.特異性抗體一抗HCvNs3單克隆抗體購自美國Boidesing公司。辣根過氧化物酶標記的驢抗羊二抗購自上�？党缮锕こ逃邢薰�。四.質粒重組質粒pBRTM肚vcl一3011由美國華盛頓大學Rcie教授惠贈，含有HVC全長基因序列�？瞻妆磉_載體peDN戶3.1〔)由我校生命科學學院孫奮勇博士惠贈，含有CMv啟動子位于多克隆位點前，復制起始點Sv40ori，抗氨節(jié)青霉素及抗G418基因�？寺≥d體pGEM一T購自S烤ma公司。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R373

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本文編號：2544307