【摘要】：目的:進行丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3基因真核表達載體的構(gòu)建,并分析鑒定其在體外培養(yǎng)的人肝細胞QSG7701中的表達。 方法:用PCR方法從含有丙肝病毒全長基因的重組質(zhì)粒pBRTM/HCV1-3011表達載體中擴增出HCV NS3基因片段,將其與表達載體pcDNA3.1(-)重組,得到重組的真核表達載體pcDNA3.1(-)/NS3。然后采用陽離子多聚體介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)染人肝細胞QSG7701,以免疫組織化學(xué)SP法檢測到細胞中NS3蛋白表達陽性后,即用G418篩選出可穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白的系統(tǒng)。對穩(wěn)定表達的細胞提取其細胞質(zhì)蛋白,用SDS-PAGE電泳及Western Blotting印跡法檢測細胞表達的HCV NS3蛋白。 結(jié)果:所得到的NS3片段大小正確,序列正確,并在兩端成功插入起始、終止密碼子和EcoRI、BamHI酶切位點。所構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染QSG7701細胞并可穩(wěn)定表達HCV NS3蛋白,表達的特異性NS3蛋白分子量為預(yù)期的70000。 結(jié)論:成功構(gòu)建了丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3基因的真核表達載體pcDNA3.1(-)/NS3,并且該載體在體外培養(yǎng)的人肝細胞中能穩(wěn)定有效地表達分子量正確的特異性HCV NS3蛋白,從而為進一步研究HCV NS3基因誘發(fā)不死化人肝細胞癌化的機制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

peDNA3.(l一)(.54k句質(zhì)粒圖譜

上游引物:GAAITC戶a，，GGCGCCC戶口，CACGGCGI人CGC，引入了EcO石夢酶切位點和翻譯起始密碼子戶JG。下游引物:CTGGACCTCCAGCAGTGCA門，CCI，AGG，引入了BamHI酶切位點和翻譯終止密碼子戶丁1，。PCR引物由上海生工生物科技公司合成。三.特異性抗體一抗HCvNs3單克隆抗體購自美國Boidesing公司。辣根過氧化物酶標記的驢抗羊二抗購自上�？党缮锕こ逃邢薰�。四.質(zhì)粒重組質(zhì)粒pBRTM肚vcl一3011由美國華盛頓大學(xué)Rcie教授惠贈，含有HVC全長基因序列�？瞻妆磉_載體peDN戶3.1〔)由我校生命科學(xué)學(xué)院孫奮勇博士惠贈，含有CMv啟動子位于多克隆位點前，復(fù)制起始點Sv40ori，抗氨節(jié)青霉素及抗G418基因。克隆載體pGEM一T購自S烤ma公司。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R373

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 畢勝利，江永珍，趙洪蘭，李景元，魯健，曹經(jīng)瑗，劉崇柏;戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因在大腸桿菌中的表達及其在診斷中的應(yīng)用[J];病毒學(xué)報;1996年02期

2 溫冷;重組桿狀病毒表達具有免疫原性的甲型肝炎病毒顆粒[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1994年02期

3 朱東;肝炎病毒病原學(xué)研究進展[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);1995年06期

4 李愛華，陳銳強;丙型肝炎病毒的母嬰傳播[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;1996年01期

5 韓鳳連,施紅;乙型肝炎病毒基因突變檢測方法的比較[J];生物技術(shù)通訊;1997年Z1期

6 李剛，彭文偉，姚集魯，呂凌;肝癌病人血清中丙型肝炎病毒E2／NS1基因區(qū)cDNA的克隆及序列分析[J];病毒學(xué)報;1995年01期

7 ;免疫電鏡觀察丙型肝炎病毒顆粒[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;1995年04期

8 李慶生，郭建平，陶其敏;丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)基因NS5在大腸桿菌中的高效表達[J];中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志;1996年03期

9 王春杰,凌瑞,王文亮,馬福成,陳萬錄,胡沛臻;蛋白激酶底物p36在肝硬變、肝細胞肝癌中的表達及與HBV、HCV感染的關(guān)系[J];中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志;1997年02期

10 楊玉英;庚型肝炎病毒的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;1997年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳欣如;侯巖巖;燕順生;;肝炎病毒動物模型的研究進展[A];中國實驗動物學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

2 吳志強;熊焰;;乙型肝炎病毒熒光定量檢測與其血清標志物檢測結(jié)果的相關(guān)性研究[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

3 謝志勤;謝芝勛;鄧顯文;龐耀珊;廖敏;劉加波;唐小飛;何競銘;;用SDS-PAGE技術(shù)分析雞毒支原體廣西分離株的結(jié)構(gòu)蛋白[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2002年

4 馮育會;;淺談肝炎病毒的致病特點[A];貴州省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會中醫(yī)診斷現(xiàn)代研究論文匯編[C];2007年

5 譚太昌;;HBsAg和HbcAb陽性患者血清前S1抗原檢測的臨床意義[A];第6次全國微生物學(xué)與免疫學(xué)大會論文摘要匯編[C];2004年

6 謝金文;沈志強;任艷玲;魏鳳;;尼帕病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會成立大會暨第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

7 劉光清;倪征;陳柳;;兔出血癥病毒次結(jié)構(gòu)蛋白(VP2)的生物學(xué)功能研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

8 黃慶秋;涂雄鷹;樓曉華;滕脈坤;牛立文;;眼鏡蛇毒三指結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究[A];中國毒理學(xué)會生物毒素毒理專業(yè)委員會第4次、中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會毒素專業(yè)組第5次學(xué)術(shù)研討會論文摘要[C];2001年

9 蘇海霞;閆永平;徐德忠;李端;盧娟;;乙型肝炎病毒前C/C和前S/S基因異質(zhì)性及其與宮內(nèi)感染關(guān)系的初步研究[A];全面建設(shè)小康社會：中國科技工作者的歷史責(zé)任——中國科協(xié)2003年學(xué)術(shù)年會論文集（下）[C];2003年

10 郭振興;季林祥;楊仁池;;干擾素治療肝炎病毒相關(guān)性血小板減少[A];第十一屆全國血栓與止血學(xué)術(shù)會議暨血栓栓塞性疾�。ㄑㄅc止血）基礎(chǔ)與臨床研究進展學(xué)習(xí)班論文摘要匯編及學(xué)習(xí)班講義[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報駐東京記者 張超;記錄頻刷：日本送別“新”的一年[N];法制日報;2010年

2 蔡fg東;酒精是肝炎病毒的“幫兇”[N];家庭醫(yī)生報;2005年

3 張荔子;肝炎病毒核酸檢測引進國際標準[N];健康報;2005年

4 王有國;肝炎病毒爭霸(接上期)[N];家庭醫(yī)生報;2006年

5 本報記者 劉凱洋;吃完飯你有剔牙習(xí)慣嗎[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

6 ;乙型肝炎病毒宮內(nèi)感染的早期診斷[N];科技日報;2005年

7 呂萍;如何認識肝炎主要癥狀的出現(xiàn)[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2008年

8 吳堅;一生可能多次得肝炎[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2008年

9 江南雪舞;形形色色的肝炎病毒[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

10 張松偉;肝炎治療誤區(qū)多[N];中國消費者報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王宏衛(wèi);庚型肝炎病毒生物學(xué)特性及其與丙型肝炎病毒的比較研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

2 曹明媚;庚型肝炎病毒作為復(fù)制型基因治療載體及小干擾RNA對病毒表達復(fù)制抑制作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 閻瑾琦;丙型肝炎病毒重組復(fù)合表位抗原的免疫原性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

4 周艷君;豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

5 趙偉;病毒性肝炎基因芯片診斷技術(shù)研究和臨床應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 陸蔭英;乙型肝炎病毒相互作用蛋白編碼基因的克隆化及新基因功能的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2003年

7 吳雨霞;口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因在原核和真核細胞中的表達[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

8 劉晶;丙型肝炎病毒被膜蛋白的表達、純化與應(yīng)用研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2002年

9 謝希賢;對蝦白斑綜合癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定及功能研究[D];廈門大學(xué);2007年

10 梁雪松;IRES特異性抑制性RNA阻斷丙型肝炎病毒基因表達的研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 江靜;丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3基因載體的構(gòu)建及其在真核細胞中的表達[D];暨南大學(xué);2005年

2 李菲;用桿狀病毒系統(tǒng)表達丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

3 關(guān)嵐;男性吸毒人群中丙型肝炎病毒感染狀況及其影響因素的研究[D];中南大學(xué);2003年

4 蘇小平;乙型肝炎病毒preS2-S基因（adr亞型）轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 葛軍輝;乙型肝炎病毒變異型s基因疫苗逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠免疫耐受的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

6 賀啟貴;門脈高壓性胃病病理初步分析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2003年

7 韓香子;延邊地區(qū)庚型肝炎病毒感染狀況的研究[D];延邊大學(xué);2001年

8 張勝權(quán);N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗乙肝病毒(HBV)作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2001年

9 趙書民;乙型肝炎病毒pres_2-s基因（ayw亞型）轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2002年

10 孫利;丙型肝炎病毒DNA疫苗的實驗研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

本文編號：2544307