【摘要】：背景與目的：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌，并與胃癌和胃粘膜相關(guān)性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。根據(jù)Hp是否含有細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白編碼基因(cytotoxin-associated protein gene A，CagA)和空泡毒素相關(guān)蛋白編碼基因(Vacuolating cytotoxin-associated protein gene A，VagA)將Hp分為Ⅰ型菌株(CagA~+、VagA~+)和Ⅱ型菌株(CagA~-、VagA~-)兩種。Ⅰ型菌株含有一個約40kb的特殊基因片段，因其編碼CagA等毒力因子而被稱為cag毒力島。1997年到1998年，2個Hp Ⅰ型菌株26695菌株和J99菌株的基因組被完全測序，使人們能夠全面了解Hp Ⅰ型菌株的基因組結(jié)構(gòu)和主要特征。鑒于Ⅰ型菌株現(xiàn)被認(rèn)為是消化道潰瘍和胃腫瘤的重要成因，因此CagA基因的研究成為Hp研究中的熱點。目前，對于治療Hp感染主要應(yīng)用抗生素和質(zhì)子泵抑制劑，但抗生素的廣泛應(yīng)用會導(dǎo)致Hp耐藥性的不斷增加，且價格昂貴，復(fù)發(fā)的機(jī)率較大。因此，預(yù)防Hp的感染十分必要和緊迫。但目前尚未研制出實用有效的Hp Ⅰ型菌株疫苗。為此，本研究擬利用分子生物學(xué)技術(shù)，建立CagA的原核表達(dá)系統(tǒng)，為Hp重組疫苗的研制提供備選抗原，同時也為Hp Ⅰ型菌株的鑒定試劑盒提供抗原參考。 方法：根據(jù)GenBank收錄的Hp CagA序列，設(shè)計PCR引物，并在每條引物前分別添加內(nèi)切酶位點。通過PCR擴(kuò)增Hp菌株的CagA基因，運(yùn)用分子克隆的經(jīng)典方法，用pGEM-T Easy載體攜帶該基因轉(zhuǎn)化工程菌JM109，繼而通過藍(lán)白實驗篩選出陽性菌落并對該基因進(jìn)行測序，將其結(jié)果與已公布的CagA基因序列比對。測序結(jié)果正確后再將CagA基因從pGEM-T Easy-CagA質(zhì)粒中切出，用表達(dá)載體pGEX-5X-1攜帶該基因轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，通過氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR挑選出陽性克隆pGEX-5X-1-CagA。而后以IPTG誘導(dǎo)含pGEX-5X-1-CagA的宿
【圖文】：

笱?005屆碩士學(xué)位論文幽門螺桿菌CgaA基因克隆及表達(dá)物，大小均與預(yù)期的一致。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。ZD00bP1000了55025DbP100bP圖5重組pGE-xsx·1一cgaAPcR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果1一5:待檢側(cè)pGE-xs-x1一caAg為模板的PcR產(chǎn)物;M:MarkerFigsScerenofereombinantPGEM一SX小CagAbyPCRC(lClZ)Lanel一5:PositvieereombniantPGEM一S-Xl一CagALaneM:DNAmar驪rDL20004重組pGEX一x5一1一Ca妞酶切的鑒定結(jié)果:對經(jīng)PCR鑒定正確后的pGEX一SX一1一CagA做EeoRI、Hindlll酶切，并以標(biāo)準(zhǔn)CagA基因及線狀pGEX一SX幾作對照進(jìn)行鑒定，酶切產(chǎn)物均與對照位置相同，證明成功構(gòu)建pGEX一SX一l一CagA。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖6。123M250bP100bP圖6酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果1:標(biāo)準(zhǔn)CgaA基因;:2線狀pGE-xs-x1;:3pGE-xs-x1一CaAg酶切后;M:MarkerFig6IdentificationofPGE-XS-Xl一CagAdigestedbyendonueleaseLanel:CagAgeneLaneZ:Plas而dPGE-XSX一1Lane3:PGE-XS-X1一CagAIEeoRI，HindlllLaneM:DNAmarkerDL20M)I5重組目的融合蛋白的表達(dá)與鑒定:5.1SDS一APGE電泳結(jié)果:對經(jīng)工PTG誘導(dǎo)表達(dá)(h6時表達(dá)量最多)，菌裂解產(chǎn)物做質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS~PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色觀察，可見在約48KD處有一明顯的誘導(dǎo)蛋白條

5.2Western一blot結(jié)果:誘導(dǎo)pGEX一sx一1一CagA重組菌表達(dá)后，western一blot結(jié)果中可見在相對分子量約48KD條帶處均出現(xiàn)特異性顯色反應(yīng)(見圖8)。說明重組表達(dá)的融合蛋白具有CagA抗原性，確為CagA的融合蛋白。圖8、Vestern一blot1:融合蛋白;M:MarkerFigs:theersultofw七stern一blotLanel:ufsionPorteinLaneM:Porteinmarker
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R378

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本文編號：2541507