【摘要】： 利用噬菌體技術檢測細菌是一類現(xiàn)代細菌檢驗方法,根據(jù)具體展開時的技術差異,又分為噬菌體擴增技術、發(fā)光噬菌體技術和裂解產(chǎn)物分析。噬菌體擴增技術將每個活宿主菌轉變?yōu)橐粋�噬菌斑,根據(jù)噬菌斑計數(shù)結果檢出宿主菌的活菌含量;發(fā)光噬菌體技術可使宿主菌發(fā)光,直接在落射熒光顯微鏡下計數(shù),或通過宿主菌繁殖噬菌體而增加發(fā)光強度,間接定量宿主菌的活菌含量;裂解產(chǎn)物分析通過測定噬菌體裂解宿主菌釋放特異物質(zhì)產(chǎn)生的信號而定量宿主菌的活菌含量。這些方法速度快、靈敏度高、專一性強且費用低廉。其中后兩種技術用于檢驗大腸桿菌的研究已有報道,但用相對更經(jīng)濟的第一種方法檢驗大腸桿菌的研究尚屬空白。 本研究以T4和三種E. coli菌株為模型材料,研究運用噬菌體擴增和實時PCR復合技術快速檢驗細菌的方法。整個研究包括五個部分。1、尋找能在很短時間內(nèi)將模擬樣品中T4宿主型大腸桿菌有效而完全侵染所需的T4濃度。2、建立離心-微濾復合技術,清洗掉樣品中游離T4和其他雜質(zhì)。3、建立受侵染大腸桿菌在膜組件內(nèi)裂解產(chǎn)生子代T4并洗脫和收集T4形成轉換樣品的適當方法。4、建立轉換樣品子代T4含量和模擬樣品大腸桿菌活菌含量之間的數(shù)量關系。5、建立運用噬菌體計數(shù)法、PCR和實時PCR定量測定轉換樣品子代T4含量的適宜技術。最后,指明本模型研究的主要進展和存在的問題。 第一部分研究結果表明:能夠在5min內(nèi)有效而完全侵染液態(tài)模擬樣品中T4宿主型大腸桿菌所必須采用的T4滴定度為109-108PFU/mL,最好為5×108PFU/mL。因為T4用量減少會發(fā)生漏侵染,T4用量過多則會增加下一步試驗中清除游離T4的負擔。在完成侵染過程后,應該立即進入離心-微濾復合清洗步驟,以避免多重侵染的發(fā)生。 第二部分研究結果表明:對于單純以大腸桿菌配制的模擬樣品, LB或TS肉湯是離心-微濾復合清洗樣品中游離T4和其他雜質(zhì)的最佳清洗劑。對于真實樣品,宜用大腸桿菌選擇性液態(tài)培養(yǎng)基作為清洗劑,從而限制樣品中其他微生物的生長。先經(jīng)兩次離心法清洗與分離,使樣品中大部分游離T4隨上清液棄去,接著將包含受侵染大腸桿菌在內(nèi)的沉淀物重新分散于肉湯,轉移到孔徑為0.2-0.22μm的聚砜或甲基纖維素注射式微濾膜組件中,再用90mL LB肉湯連續(xù)以微濾方式清洗與分離,將樣品中剩余的游離T4清除,并將已受侵染的大腸桿菌截留在膜組件中。整個清洗操作在30 min內(nèi)完成,所以清洗中不損失子代T4。 第三部分的研究結果表明:截留在膜組件內(nèi)的受侵染大腸桿菌宜在膜組件內(nèi)完成產(chǎn)生子代T4的過程。在結束清洗時,使用一次性使用針管和針頭帽將膜組件封閉以防樣品被環(huán)境污染,轉入37℃培養(yǎng)箱保溫,受侵染的大腸桿菌依靠膜組件內(nèi)剩余的肉湯提供營養(yǎng),絕大多數(shù)在50min內(nèi)完成裂解。在保溫90min時,使用定量的SM buffer洗脫膜組件中子代T4,收集濾出的洗脫液就得到轉換樣品。轉換樣品組成相當簡單,它不含有細胞和雜質(zhì),介質(zhì)為SM buffer,殘留的游離T4很少且含量穩(wěn)定,只有子代T4和大腸桿菌裂解產(chǎn)生的可濾出物的數(shù)量未知,為定量分析子代T4的理想樣品。 根據(jù)以上研究結果和T4測定方法,本研究確立了液態(tài)模擬樣品的系統(tǒng)轉換方法。當采用噬菌斑計數(shù)法測定T4含量時,樣品轉換法如下:向0.9mL液態(tài)模擬樣品中加入0.1mL的T4工作液(T4滴定度≥4×109PFU/mL)形成1mL起始樣液,輕輕振搖中于37℃保溫5min,接著在12000rpm下離心2min,棄去上清液,沉淀重新分散在1mL LB肉湯中,重復相同的‘離心-重新分散’操作兩次,將最后一次重新分散液完全轉入膜孔為0.2-0.22μm的聚砜或甲基纖維素注射式膜組件中,經(jīng)過9次微濾式洗濾(每次用10mL LB肉湯并棄去濾液)后,保持針管和膜組件連結,并在膜組件出口戴上一次性使用的針頭帽,將封閉的膜組件轉入37℃培養(yǎng)箱,保溫90min時取出,用10mL SM buffer洗脫子代T4,收集濾液得到轉換樣品。當采用PCR或?qū)崟rPCR法測定T4含量時,樣品轉換法除一點改動外,其他完全與上述樣品轉換方法相同。這一改動是:用1mL SM buffer代替10 mL SM buffer洗脫并收集子代T4。 第四部分的研究結果表明: 將Escherichia coli B,Escherichia coli K 12或Escherichia coli AMC 198(代表T4宿主型大腸桿菌菌株)配制的模擬樣品用上述方法進行樣品轉換,模擬樣品T4宿主型大腸桿菌活菌數(shù)的對數(shù)和轉換樣品子代T4數(shù)量的對數(shù)呈線性關系,通過試驗數(shù)據(jù)的回歸分析,這種關系展示為一元線性回歸方程。理論分析說明:決定該方程的斜率和截距的因素包括樣品轉換中受侵染大腸桿菌的營養(yǎng)供給、使用的清洗劑種類、使用的膜組件、參試的大腸桿菌菌株和樣品轉換的試驗操作方法。 Pseudomonas fluorescens或Citrobacter Froundii(代表T4宿主型大腸桿菌以外的其他微生物)存在于樣品中時不引起轉換樣品子代T4含量增加,但它們具有爭奪營養(yǎng)而降低受侵染大腸桿菌產(chǎn)生子代T4數(shù)量的可能性,應通過樣品轉換中供給受侵染大腸桿菌充足營養(yǎng)并采用大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基為清洗劑而加以消除。 當樣品轉換中采用大腸桿菌選擇性培養(yǎng)基為清洗劑、固定采用一種膜組件、注意保證供給受侵染大腸桿菌充分的營養(yǎng)和保持操作方法始終如一時,樣品中T4宿主型大腸桿菌數(shù)量對數(shù)和轉換樣品子代T4數(shù)量對數(shù)間的一元線性回歸方程就只和參試菌株有關。所以,從一類樣品中分離出大腸桿菌做為混合參試菌株進行模擬試驗得出的方程,可在以后檢驗同類樣品的T4宿主型大腸桿菌活菌含量時應用。第五部分的研究結果表明: 噬菌斑計數(shù)法是測定轉換樣品T4含量的可靠方法之一,將它和第一種樣品轉換方法結合形成的T4宿主型大腸桿菌檢驗方法簡單可行,該方法測定模擬樣品時的檢測極限約為20CFU/mL,整個檢驗過程需時8-9h。 PCR可作為粗略定量測定轉換樣品中T4含量的一種方法。源于T4 ligase基因序列的一對引物的專一性和靈敏度較高,這對引物用于PCR時的最適退火溫度為58℃。將換樣品制成模板樣液時使用水煮法的效果相當良好。以系列轉換樣品制成系列模板樣液,在優(yōu)化的條件下進行PCR和電泳分析,可以區(qū)別系列轉換樣品中T4含量的差異,檢測極限為500PFU/mL。 實時PCR可以精確測定轉換樣品T4含量。采用Light Cycler Fast Start DNA Master plus SYBR Green I復合試劑的擴增效率明顯高于采用普通實時PCR試劑。當采用這種復合試劑和Lig F和Lig R引物時,適宜的實時PCR條件為:各引物的濃度控制為0.5mM,反應體系總體積為20μL,模板樣液用量為5μL,退火溫度和時間為61℃和5sec,延伸溫度和時間為72℃和10sec,第一個循環(huán)的變性溫度和時間為95℃和5min,其他循環(huán)的變性溫度和時間為95℃和8sec。當以濃度10倍遞減的T4 DNA水溶液為系列模板樣液進行試驗時,實時PCR擴增曲線等距排列,系列Ct值等差遞增,熔點曲線僅含特異擴增產(chǎn)物峰,其熔點約為82℃;當以水煮系列轉換樣品制備的系列模板樣液進行試驗時,實時PCR擴增曲線依次排開,系列Ct依次遞增,檢測極限約為35PFU/mL。表明實時PCR可作為高靈敏度定量測定轉換樣品T4含量的一種方法。將它和樣品轉換法以及水煮法制備模板樣液的技術結合,可在3.5h以內(nèi)完成T4宿主型大腸桿菌的定量檢測。 總之,本研究開創(chuàng)了一種快速檢驗T4宿主型大腸桿菌的方法。它通過2h的樣品轉換過程將T4宿主型大腸桿菌以確定的數(shù)量關系轉換為子代T4,再通過1h左右的實時PCR分析過程測出轉換樣品中子代T4的數(shù)量,接著就可計算出樣品中T4宿主型大腸桿菌的活菌數(shù)。這種方法不能測定非T4宿主型大腸桿菌,需要找出能夠侵染各種大腸桿菌的噬菌體代替T4解決這一問題。雖然存在這種缺陷,但本方法作為一種具有廣泛利用空間的新技術雛型,預計有良好的發(fā)展和應用前景。
【圖文】：

用量為 10μL。除了退火溫度外，PCR 反應進程按數(shù)執(zhí)行，通過改變退火溫度和引物工作液的使用體每種引物使用濃度（0.5 或 0.68 p mol/μL）的 4 種較 PCR 產(chǎn)物電泳分析的結果，找出相對最好的反-13 9 次優(yōu)化試驗的退火溫度和每種引物在反應體系中的nealing temps and primer concentrations of the 9 experiments退火溫度 /℃Temp. ofannealing引物工作液使用體積Volume of primerWorking solution反應體系中濃度/ (pPrimer final60 0.8 060 1.2 160 1.6 158 0.8 058 1.2 158 1.6 156 0.8 056 1.2 156 1.6 1

10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8圖 4-8 使用第一對引物時的 PCR 產(chǎn)物的電泳圖像Ⅱmage of electrophoresis of PCR products using the first pair of應體系總體積 25μL ，， Lig F 和 Lig R 為引物，引物濃度為 1.2 p mo液為濃度為 392.5 μg/mL T4 DNA 的連續(xù) 10 倍稀釋液，模板樣液加凝膠，80V/12cm, 40min，PCR 產(chǎn)物樣液用量 5μL。Ladder, 10- 3, 10- 4, 10- 5, 10- 6, 10- 7, 108圖 4-9 使用第二對引物時的 PCR 產(chǎn)物的電泳圖像mage of electrophoresis of PCR products using the second pair
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 吳健敏,涂長春,任兆鈞;T4噬菌體表面展示技術的研究進展[J];病毒學報;2004年04期

2 馬穎,龍騰銳,方振東;PCR技術檢測飲用水中大腸桿菌[J];中國給水排水;2004年09期

3 黃輝萍,許能鋒;消毒劑滅活病毒效果的評價方法及其研究進展[J];國外醫(yī)學.病毒學分冊;2005年02期

4 李軍生,葉云,梁超香,何仁;免疫檢測技術在食品檢驗中的應用[J];廣西工學院學報;2005年01期

5 龔鑫萍,馬炳榮;微過濾在除菌處理中的應用[J];膜科學與技術;2002年02期

6 陳思;黃昆侖;許文濤;李媛;羅云波;;實時熒光定量PCR方法檢測大腸桿菌O157:H7[J];農(nóng)業(yè)生物技術學報;2006年05期

7 陳萍,李仁寬,徐小華,饒平凡;毛細管電泳法快速分離和檢測腸毒性大腸桿菌[J];色譜;2002年05期

8 吳健敏,任兆鈞,余興龍,涂長春,張念祖;利用T4噬菌體展示豬瘟病毒E2抗原[J];中國生物工程雜志;2004年11期

9 楊繼章,陳大華,楊樹民;抗病毒藥物的研究進展及臨床應用[J];上海醫(yī)藥;2005年08期

10 楊玉志,張春秀,唐祖明,陸祖宏;毛細管電泳在微生物分離與檢測中的應用[J];微生物學雜志;2005年04期

本文編號：2537828