發(fā)布時(shí)間：2019-09-12 00:56

【摘要】： 目的:研究大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)對(duì)體外缺氧海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖、分化和凋亡的影響,為VECs和NSCs共培養(yǎng)移植治療缺血缺氧性疾病提供科學(xué)依據(jù)。 方法:1、新生1～3d的Wistar大鼠大腦海馬培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,采用免疫組織化學(xué)方法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。2、取出生1～7d的Wistar大鼠大腦培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)其鑒定。3、將培養(yǎng)傳代純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞液后接種于涂有多聚賴氨酸包被的蓋玻上,接種傳3代后用胰酶消化的神經(jīng)干細(xì)胞,以1:10接種比例加入神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液共培養(yǎng)。4、用無(wú)菌石蠟油覆蓋于低糖細(xì)胞培養(yǎng)液表面,制備低氧低糖溶液。對(duì)照組:正常神經(jīng)干細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2,飽和濕度培養(yǎng);缺氧共培養(yǎng)組:取共培養(yǎng)3d細(xì)胞,吸出培養(yǎng)液,用無(wú)菌Hank’s緩沖液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2h、4h、8h和28h后換液,用PBS緩沖液沖洗3次后,換神經(jīng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng);缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組:取傳3代的神經(jīng)干細(xì)胞,用無(wú)菌Hank’s緩沖液清洗2次后,方法同上。5、免疫組織熒光鑒定缺氧條件下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與凋亡,免疫組織化學(xué)鑒定缺氧條件下神經(jīng)干細(xì)胞的分化。 結(jié)果: 1、NSCs和VECs培養(yǎng)及鑒定:原代分離的單個(gè)NSC 4d增生為神經(jīng)細(xì)胞球,傳代后,經(jīng)nestin免疫熒光染色,細(xì)胞球呈陽(yáng)性;原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞6-8d長(zhǎng)滿瓶壁,細(xì)胞呈多角形或扁平梭形,核卵圓形,VIII因子相關(guān)抗原陽(yáng)性。 2、各組神經(jīng)干細(xì)胞光鏡形態(tài)變化特點(diǎn):正常對(duì)照組NSCs胞體飽滿,折光性強(qiáng),周圍有光暈。缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組NSCs胞體腫脹,折光性差,有大量的細(xì)胞碎屑,并出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞。缺氧共培養(yǎng)組NSCs形態(tài)有所改善,細(xì)胞折光性仍較好,大部分細(xì)胞突起仍未見(jiàn)回縮,僅少數(shù)NSCs腫脹,壞死。 3、缺氧時(shí)間與新生大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞活性的關(guān)系:分別缺氧培養(yǎng)2h、4h、8h和28h后復(fù)氧培養(yǎng)48h,NSCs隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞死亡明顯增多,NSCs存活率明顯下降;缺氧共培養(yǎng)組的NSCs形態(tài)有所改善,細(xì)胞折光性仍較好,大部分NSCs突起仍未見(jiàn)回縮,僅少數(shù)細(xì)胞腫脹,共培養(yǎng)組NSCs存活率高于單純?nèi)毖鮊SCs組(P0.05)。 4、缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響:腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化數(shù)目與單純?nèi)毖跎窠?jīng)細(xì)胞分化相比,明顯增多,但對(duì)分化后所形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例影響很小,通過(guò)計(jì)數(shù),沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5、缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,凋亡的影響:缺氧共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖細(xì)胞數(shù)目高于缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組(P0.05),細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目率低于缺氧單純神經(jīng)干細(xì)胞組(P0.05)。 結(jié)論:缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有保護(hù)作用;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖及分化、抑制其凋亡。
【圖文】：

圖 1 培養(yǎng) 14d 的神經(jīng)干細(xì)胞球（相差顯微鏡，200×）圖 3 培養(yǎng) 14d 的 nestin 陽(yáng)性細(xì)胞（相差顯微鏡 100×）圖 4. 腦微內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 7d(相差顯微鏡 400×)圖 2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代分化培養(yǎng) 21d(相差顯微鏡400×)

圖 1 培養(yǎng) 14d 的神經(jīng)干細(xì)胞球（相差顯微鏡，，200×）圖 3 培養(yǎng) 14d 的 nestin 陽(yáng)性細(xì)胞（相差顯微鏡 100×）圖 4. 腦微內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 7d(相差顯微鏡 400×)圖 2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代分化培養(yǎng) 21d(相差顯微鏡400×)
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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