【摘要】： 目的:研究大鼠腦微血管內皮細胞(VECs)對體外缺氧海馬神經干細胞(NSCs)增殖、分化和凋亡的影響,為VECs和NSCs共培養(yǎng)移植治療缺血缺氧性疾病提供科學依據。 方法:1、新生1～3d的Wistar大鼠大腦海馬培養(yǎng)神經干細胞,采用免疫組織化學方法鑒定神經干細胞。2、取出生1～7d的Wistar大鼠大腦培養(yǎng)腦微血管內皮細胞,采用免疫細胞化學方法對其鑒定。3、將培養(yǎng)傳代純化的腦微血管內皮細胞,用0.25%胰酶消化成單細胞液后接種于涂有多聚賴氨酸包被的蓋玻上,接種傳3代后用胰酶消化的神經干細胞,以1:10接種比例加入神經細胞完全培養(yǎng)液共培養(yǎng)。4、用無菌石蠟油覆蓋于低糖細胞培養(yǎng)液表面,制備低氧低糖溶液。對照組:正常神經干細胞置于37℃、體積分數為0.05的CO2,飽和濕度培養(yǎng);缺氧共培養(yǎng)組:取共培養(yǎng)3d細胞,吸出培養(yǎng)液,用無菌Hank’s緩沖液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2h、4h、8h和28h后換液,用PBS緩沖液沖洗3次后,換神經細胞完全培養(yǎng)液,置于細胞培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng);缺氧單純神經干細胞組:取傳3代的神經干細胞,用無菌Hank’s緩沖液清洗2次后,方法同上。5、免疫組織熒光鑒定缺氧條件下神經干細胞的增殖與凋亡,免疫組織化學鑒定缺氧條件下神經干細胞的分化。 結果: 1、NSCs和VECs培養(yǎng)及鑒定:原代分離的單個NSC 4d增生為神經細胞球,傳代后,經nestin免疫熒光染色,細胞球呈陽性;原代培養(yǎng)腦微血管內皮細胞6-8d長滿瓶壁,細胞呈多角形或扁平梭形,核卵圓形,VIII因子相關抗原陽性。 2、各組神經干細胞光鏡形態(tài)變化特點:正常對照組NSCs胞體飽滿,折光性強,周圍有光暈。缺氧單純神經干細胞組NSCs胞體腫脹,折光性差,有大量的細胞碎屑,并出現懸浮死細胞。缺氧共培養(yǎng)組NSCs形態(tài)有所改善,細胞折光性仍較好,大部分細胞突起仍未見回縮,僅少數NSCs腫脹,壞死。 3、缺氧時間與新生大鼠大腦皮質神經干細胞活性的關系:分別缺氧培養(yǎng)2h、4h、8h和28h后復氧培養(yǎng)48h,NSCs隨著缺氧時間的延長,細胞死亡明顯增多,NSCs存活率明顯下降;缺氧共培養(yǎng)組的NSCs形態(tài)有所改善,細胞折光性仍較好,大部分NSCs突起仍未見回縮,僅少數細胞腫脹,共培養(yǎng)組NSCs存活率高于單純缺氧NSCs組(P0.05)。 4、缺氧條件下腦微血管內皮細胞對神經干細胞分化的影響:腦微血管內皮細胞對缺氧神經干細胞分化為神經元和膠質細胞的分化數目與單純缺氧神經細胞分化相比,明顯增多,但對分化后所形成神經元和神經膠質細胞的比例影響很小,通過計數,沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5、缺氧條件下腦微血管內皮細胞對神經干細胞增殖,凋亡的影響:缺氧共培養(yǎng)組細胞增殖細胞數目高于缺氧單純神經干細胞組(P0.05),細胞凋亡細胞數目率低于缺氧單純神經干細胞組(P0.05)。 結論:缺氧條件下腦微血管內皮細胞對神經干細胞有保護作用;腦微血管內皮細胞可以促進缺氧神經干細胞的存活、增殖及分化、抑制其凋亡。
【圖文】：

圖 1 培養(yǎng) 14d 的神經干細胞球（相差顯微鏡，200×）圖 3 培養(yǎng) 14d 的 nestin 陽性細胞（相差顯微鏡 100×）圖 4. 腦微內皮細胞原代培養(yǎng) 7d(相差顯微鏡 400×)圖 2 神經干細胞傳代分化培養(yǎng) 21d(相差顯微鏡400×)

圖 1 培養(yǎng) 14d 的神經干細胞球（相差顯微鏡，，200×）圖 3 培養(yǎng) 14d 的 nestin 陽性細胞（相差顯微鏡 100×）圖 4. 腦微內皮細胞原代培養(yǎng) 7d(相差顯微鏡 400×)圖 2 神經干細胞傳代分化培養(yǎng) 21d(相差顯微鏡400×)
【學位授予單位】：佳木斯大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

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