【摘要】： 目的 為了滿足皮膚科學(xué)基礎(chǔ)和臨床發(fā)展的需要，近年來人們進(jìn)行體外重建皮膚的各種嘗試。在實(shí)驗(yàn)室重建的皮膚，是由種子細(xì)胞或皮瓣在真皮替代物上進(jìn)行誘導(dǎo)、發(fā)育、分化成類似在體皮膚的完整表皮，稱為人工皮膚或皮膚替代物。這種人工皮膚一般應(yīng)具有表皮和真皮雙層結(jié)構(gòu)并具備皮膚的生物學(xué)特征。隨著種子細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和真皮替代物的發(fā)展，人工皮膚不僅用于創(chuàng)傷(如燒傷)后皮膚的移植和修復(fù)，還可用于皮膚發(fā)育、皮膚病發(fā)病機(jī)理等的研究，有著廣闊的應(yīng)用前景。 多年來人們期望在體外建立一種能夠模擬在體皮膚損傷修復(fù)過程的模型，即損傷邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞分裂增殖，向創(chuàng)面移行，最后覆蓋創(chuàng)面，新生表皮完成修復(fù)和重塑的過程。這一過程涉及到與表皮發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞增殖、遷移和分化三個(gè)重要步驟。對(duì)這一過程的研究可以幫助了解和深入研究與皮膚發(fā)育和修復(fù)相關(guān)的諸多問題，從而具有潛在的基礎(chǔ)理論價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用前景。為此，本研究應(yīng)用器官型培養(yǎng)技術(shù)，利用去表皮的真皮組織(de-epidermized dermis，DED)作為真皮替代物，擬建立一種以觀察表皮發(fā)育并以熒光素跟蹤測(cè)量表皮生長(zhǎng)的皮膚體外重建模型，用于研究表皮的修復(fù)以及生物、藥物等因素對(duì)表皮發(fā)育的影響。 材料和方法 一、真皮替代物制備及器官培養(yǎng) 1、去表皮的真皮組織(DED)制備：健康成人皮膚標(biāo)本用PBS清洗數(shù)次，將標(biāo)本表皮向下，真皮向上平展于超凈工作臺(tái)的平臺(tái)上，在解剖顯微鏡下用眼科彎剪仔細(xì)去除皮下組織，至到約2.5mm厚，用10mm的活檢器取材，將取下的標(biāo)本浸于PBS中，然后置于56℃的水浴箱中30min，取出后將表皮與真皮分離，去除表皮。將真皮部分(DED)置于平皿中室溫下約1h將其涼干，后放置于聚乙烯塑料瓶中，加一滴DMSO，封閉瓶蓋，迅速置入液氮(-120～-160)中約5～7min，取出后于室溫放置30min，然后再置入液氮中。這樣連續(xù)反復(fù)10個(gè)循環(huán)，將DED中細(xì)胞成分殺死。后將其放入-76℃冰箱中備用。 2、支撐架的制備：為使表皮組織能在空氣-液面培養(yǎng)，將70μm目篩的細(xì)胞過濾器修剪成培養(yǎng)支撐架，放入6孔培養(yǎng)皿的培養(yǎng)孔中。培養(yǎng)液能夠通暢地穿過孔篩，保障表皮組織在接觸空氣的液面生長(zhǎng)。 3、微小皮瓣的制備：取健康人正常皮膚，用PBS清洗數(shù)次，置于超凈工作臺(tái)，自然平展標(biāo)本，用2mm活檢器取樣，在解剖顯微鏡下用剪刀小心去除皮下組織及深層真皮，保留淺層真皮組織，然后將標(biāo)本的真皮面輕沾混合組織膠，表皮部分朝上，真皮部分朝下，置于DED上。然后將DED移至六孔培養(yǎng)皿的支撐架上，每孔加約5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液，空氣—液面培養(yǎng)，2-3天換液一次。 4、培養(yǎng)液配制：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM與F-12營(yíng)養(yǎng)液3∶1混合，胰島素(5μg／ml)，腺嘌磷(0.18mM)，氫化考的松(0.5μg／ml)，霍亂弧菌毒素(10~(-10)M)，鏈霉素(100μg／ml)，青霉素(100 units／ml)，1％非必需氨基酸，10％胎牛血清。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加其它成分。 二、組織結(jié)構(gòu)及分化標(biāo)記物檢測(cè) 1、組織結(jié)構(gòu)檢測(cè)：用光鏡、透射及掃描電鏡觀察DED及新生表皮組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)。與此相關(guān)的組織染色包括蘇木素-伊紅染色，過碘酸雪夫氏染色，苦味酸-酸性品紅染色，間苯二酚-堿性品紅染色，苦味酸-酸性品紅與間苯二酚-堿性品紅雙染色等。 2、免疫組化檢測(cè)：與細(xì)胞增殖相關(guān)的檢測(cè)包括：Ki67抗原，5-溴脫氧尿嘧啶核苷，Hoechst33258；與細(xì)胞分化相關(guān)的檢測(cè)包括：角蛋白-1，角蛋白-14，包膜蛋白，beta-1整合素，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶-1；與組織或細(xì)胞鑒定相關(guān)的檢測(cè)包括：Vimentin，Ⅳ型膠原，CD1a，Me1-5，板層素等。 三、螢光成像測(cè)量新生表皮生長(zhǎng) 1、螢光素配制：二乙酸螢光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)和5-氯甲基二乙酸螢光素(5-chloromethylfluorescein diacetate，CMFDA)作為螢光素用于本實(shí)驗(yàn)，發(fā)光波峰分別為：490／515nm和492／516nm。FDA及CMFDA的儲(chǔ)藏濃度為24mM，于-20℃避光，冰柜保存。工作濃度為2.4μM。 2、表皮生長(zhǎng)及螢光成像測(cè)量：將新配制的FDA或CMFDA約150μl輕輕加至培養(yǎng)物表面，然后移到螢光顯微鏡下觀察，以新生表皮呈蘭色螢光判斷表皮生長(zhǎng)，并用數(shù)碼相機(jī)攝像。在螢光顯微鏡下攝像后棄去螢光素，培養(yǎng)皿中加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。后用圖像分析軟件計(jì)算新生表皮生長(zhǎng)螢光面積(πr~2)，計(jì)算時(shí)除去皮瓣面積，即實(shí)際新生表皮生長(zhǎng)面積mm~2=新生表皮生長(zhǎng)螢光面積—皮瓣面積。 3、新生表皮增殖活性的測(cè)量：用Leica’s Q500成像分析軟件測(cè)量新生表皮厚度，有核細(xì)胞層數(shù)，表皮突指數(shù)(基底膜長(zhǎng)度／表皮生長(zhǎng)長(zhǎng)度)及新生表皮增殖細(xì)胞密度(基底細(xì)胞及鄰近的棘細(xì)胞Ki67陽(yáng)性或BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／每毫米基底膜長(zhǎng)度(mm)=新生表皮增殖細(xì)胞密度)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析選用GraphPad Prism 4.00 for Windows軟件包和SPSS 11 for Windows軟件包。數(shù)據(jù)均值與標(biāo)準(zhǔn)差以(?)±SD表示。P值≤0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 一、重建表皮及真皮替代物特征 1、去表皮的真皮組織(DED)的生物學(xué)特性：PAS染色可見DED表面存在一條均勻一致的紫紅色帶、顯示PAS反應(yīng)陽(yáng)性，說明DED的表層含有較多量的中性粘多糖。用免疫組化方法顯示在4DED表面PAS反應(yīng)陽(yáng)性相同部位有Ⅳ膠原的均勻著色，說明DED的表面存在基底膜的蛋白成分。用透射電鏡觀察到重建表皮與真皮之間部分基底膜結(jié)構(gòu)及表皮側(cè)的半橋粒結(jié)構(gòu)。免疫組化Vimentin染色顯示DED無成纖維細(xì)胞。經(jīng)苦味酸-酸性品紅染色，間苯二酚-堿性品紅染色，苦味酸-酸性品紅與間苯二酚-堿性品紅雙染色等顯示DED組織中富含膠元纖維及彈力纖維。掃描電鏡觀察到DED中交錯(cuò)排列的致密膠元纖維。 2、重建表皮結(jié)構(gòu)特征：培養(yǎng)10天后，光鏡下可見DED上有完整的表皮結(jié)構(gòu)。表皮與人工真皮犬牙交錯(cuò)，表皮突呈高低不平的乳頭狀伸入真皮。在缺失基底膜的DED側(cè)面生長(zhǎng)的新生表皮，結(jié)構(gòu)完整性嚴(yán)重缺陷，與相同時(shí)間在DED表面生長(zhǎng)的新生表皮比較，盡管也有角質(zhì)層的形成，但表皮細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙。掃描電鏡顯示基底層與真皮連接處的纖維絲狀結(jié)構(gòu)。透射電鏡可觀察到棘細(xì)胞漿中成束排列的張力細(xì)絲，細(xì)胞漿中有類似黑素小體的結(jié)構(gòu)，但角蛋白小體不明顯。相鄰棘細(xì)胞間可見突起的橋粒結(jié)構(gòu)。在正常皮膚中，可觀察到免疫組化CD1a染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞分布于表皮的基底層，，棘層及真皮淺層。培養(yǎng)3天后，微小皮瓣表皮中仍見少量CD1a陽(yáng)性細(xì)胞。重建的新生表皮中無CD1a陽(yáng)性細(xì)胞。同樣，重建的新生表皮中Me1-5染色陰性。說明重建表皮無朗格漢斯細(xì)胞，也無黑素細(xì)胞。氣-液面培養(yǎng)20天后，角質(zhì)層明顯增厚，仍可見基底層有核細(xì)胞分裂增殖。 3、重建表皮表達(dá)分化蛋白標(biāo)記： (1)重建表皮表達(dá)角蛋白-1：角蛋白-1是表皮組織分化的早期蛋白標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)顯示在培養(yǎng)第10天的新生表皮中角蛋白-1主要表達(dá)于基底層以上的表皮內(nèi)。與正常皮膚中的表達(dá)部位基本一致。 (2)重建表皮表達(dá)角蛋白-14：本實(shí)驗(yàn)顯示在培養(yǎng)第10天的表皮中，角蛋白-14主要表達(dá)在新生表皮的基底層，部分靠近基底層的棘層角質(zhì)形成細(xì)胞中。培養(yǎng)20天后，大量角質(zhì)層組織形成，而角蛋白-14仍然清晰地呈現(xiàn)于基底層及部分棘層內(nèi)。與正常皮膚中的表達(dá)部位基本一致。 (3)重建表皮表達(dá)包膜蛋白：本實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)第5天后，包膜蛋白表達(dá)于新生表皮基底層以上的表皮中，包括棘層，顆粒層及角質(zhì)層。培養(yǎng)第6天，包膜蛋白在上述部位的表達(dá)更加清晰。培養(yǎng)第9天，包膜蛋白清晰地分布于顆粒層及角質(zhì)層，棘層KC不表達(dá)。培養(yǎng)第12天，包膜蛋白呈帶狀分布于臨近顆粒層的棘層上部及顆粒層。 (4)重建表皮表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶-1：本實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)第10天后，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶-1主要表達(dá)于棘層及顆粒層，基底層也有弱表達(dá)。 (5)重建表皮表達(dá)β-整合素：本實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)第10天后，β-整合素主要表達(dá)于新生表皮的基底層及棘層中。 4、重建表皮表達(dá)細(xì)胞增殖標(biāo)記物： (1)表皮增殖細(xì)胞表達(dá)Ki67抗原：正常表皮的基底層可見Ki67陽(yáng)性細(xì)胞，表皮增殖細(xì)胞密度為5.47±1.27；培養(yǎng)1天后，新生表皮基底層有較多的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞，新生表皮增殖細(xì)胞密度為42.32±4.54；培養(yǎng)3天后，新生表皮基底層細(xì)胞增殖活躍，新生表皮增殖細(xì)胞密度為50.86±3.67；培養(yǎng)10天后，新生表皮結(jié)構(gòu)逐漸完整，基底層及臨近的棘層中角質(zhì)形成細(xì)胞分裂仍然活躍，新生表皮增殖細(xì)胞密度為33.79±3.27；培養(yǎng)20天后，新生表皮形成較厚的角質(zhì)層，基底層仍見較多K67陽(yáng)性細(xì)胞，新生表皮增殖細(xì)胞密度為21.668±4.40。 (2)表皮增殖細(xì)胞被5-溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記：Brdu陽(yáng)性細(xì)胞清晰地表達(dá)于新生表皮的基底層，少數(shù)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞也可見于近基底層的棘層角質(zhì)形成細(xì)胞中。 二、熒光定量檢測(cè)新生表皮生長(zhǎng)面積 1、表皮生長(zhǎng)的熒光及組織學(xué)檢測(cè)：微小皮瓣接種于DED上1天后，即有角質(zhì)形成細(xì)胞開始在皮瓣的邊緣向外生長(zhǎng)并與DED面接觸(見圖3)。2-3天后在皮瓣與DED面之間形成多層的表皮樣結(jié)構(gòu)，然后新生表皮向下包繞皮瓣，同時(shí)沿著DED面向外生長(zhǎng)，這時(shí)可以在螢光顯微鏡下觀察到完整或欠缺的螢光環(huán)(見圖4)。5-7天后新生表皮繼續(xù)沿DED面生長(zhǎng)，表皮突形成，從基底層到角質(zhì)層表皮發(fā)育顯現(xiàn)完整并日漸成熟，而皮瓣下的新生表皮也完成了銜接，盡管無角質(zhì)層的呈現(xiàn)，但可見發(fā)育較好的有核細(xì)胞的表皮，可見多個(gè)表皮突伸向真皮。這時(shí)在螢光顯微鏡下可以觀察到螢光環(huán)更加明顯，半徑增大。10-12天新生表皮幾乎覆蓋整個(gè)DED表面，然后原皮瓣開始從新生表皮分離脫落，同時(shí)螢光顯微鏡可觀察到DED表面的圓形光面。 2、熒光測(cè)量表皮生長(zhǎng)的重復(fù)性及有效性測(cè)試： (1)批內(nèi)變異：用CMFDA及FDA進(jìn)行批內(nèi)變異測(cè)試。CMFDA組：標(biāo)本取自整形外科，健康人腹部皮膚(61歲婦女)。取36塊微小皮瓣分別培養(yǎng)于DED上，于培養(yǎng)的第2天，5天，7天，9天換液時(shí)，用CMFDA熒光素在熒光顯微鏡下標(biāo)記新生表皮生長(zhǎng)并攝像，然后測(cè)量計(jì)算表皮生長(zhǎng)面積，批內(nèi)變異分別是41.2％(2天)，18.8％(5天)，12.87％(7天)，9.47％(9天)。FDA組：另取一34歲健康婦女乳房區(qū)皮膚，將24塊微小皮瓣于DED上培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3天，5天，7天，10天換液時(shí)，用FDA熒光素在熒光顯微鏡下標(biāo)記新生表皮生長(zhǎng)并攝像，然后測(cè)量計(jì)算表皮生長(zhǎng)面積，批內(nèi)變異分別是34.1％(3天)，22.3％(5天)，13.79％(7天)，10.99％(10天)。 (2)批間變異：標(biāo)本分別來自不同個(gè)體和不同部位。分別為A，B，C，D四組。組A：標(biāo)本為34歲女性乳房區(qū)皮膚；組B：標(biāo)本為51歲男性腹部皮膚；組C：標(biāo)本為50歲女性腹部皮膚；組D：38歲女性乳房區(qū)皮膚。分別于培養(yǎng)的第3天，5天，7天，10天換液時(shí)，用FDA熒光素在熒光顯微鏡下觀察新生表皮生長(zhǎng)，然后在培養(yǎng)的第3天，第5天，第7天，第10天，分別計(jì)算四組新生表皮生長(zhǎng)面積，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(One-way Anova)，四組間新生表皮生長(zhǎng)面積均值有顯著差異(P＜0.01，3天；P＜0.01，5天；P＜0.01，7天；P＜0.01，10天)。 (3)熒光素FDA及CMFDA對(duì)表皮生長(zhǎng)的影響：為了解熒光素FDA及CMFDA對(duì)表皮生長(zhǎng)的影響，我們用36個(gè)微小皮瓣隨機(jī)分為三組：FDA組，CMFDA組和DMSO對(duì)照組。每組12個(gè)微小皮瓣進(jìn)行器官培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)共10天。FDA組和CMFDA組：于培養(yǎng)的第3天，第5天，第7天及第10天分別加FDA或CMFDA攝像并計(jì)算表皮生長(zhǎng)面積；DMSO組：于培養(yǎng)的第3天，第5天，第7天加同劑量的DMSO并于第10天加FDA攝像并計(jì)算新生表皮生長(zhǎng)面積。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在第3天、5天、7天、10天，F(xiàn)DA組和CMFDA組新生表皮生長(zhǎng)面積均值比較無顯著性差異(P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05)。在培養(yǎng)第10天FDA、CMFDA和DMSO三組間新生表皮生長(zhǎng)面積均值比較也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，One-way Anova)。 三、表皮生長(zhǎng)因子及糖皮質(zhì)激素對(duì)表皮生長(zhǎng)的影響 1、表皮生長(zhǎng)因子對(duì)表皮生長(zhǎng)的影響：用24個(gè)微小皮瓣隨機(jī)分為二組：EGF組(含10ng／ml EGF)和無EGF對(duì)照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)液)。培養(yǎng)3天后EGF組新生表皮生長(zhǎng)面積為(3.77±1.31)，比較對(duì)照組(2.077±0.152)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=4.58，p＜0.01；5天后EGF組新生表皮生長(zhǎng)面積為(19.52±1.08)，比較對(duì)照組(11.18±0.63)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=6.52，p＜0.01；7天后EGF組新生表皮生長(zhǎng)面積為(26.25±2.37，)，比較對(duì)照組(13.33±2.40)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，t=14.89，p＜0.01；10天后EGF組新生表皮生長(zhǎng)面積為(28.04±0.64)，比較對(duì)照組(17.72±1.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異t=8.34，p＜0.01。EGF組新生表皮生長(zhǎng)厚度(91.2±11.2)明顯高于對(duì)照組(60.9±7.22)，p＜0.01；新生表皮有核細(xì)胞的細(xì)胞層數(shù)(10.4±0.73)明顯多于對(duì)照組(8.1±0.58)，p＜0.05；新生表皮突增殖指數(shù)(1.49±0.03)明顯多于對(duì)照組(1.25±0.03)，p＜0.05；新生表皮增殖細(xì)胞密度(41.8±2.42)明顯高于對(duì)照組(35.3±3.06)，p＜0.05。 2、倍他米松戊酸酯對(duì)表皮生長(zhǎng)的影響：用24個(gè)微小皮瓣隨機(jī)分為二組：倍他米松戊酸酯組(含10~(-3)M倍他米松戊酸酯)和對(duì)照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)液)。培養(yǎng)第9天，倍他米松戊酸酯組新生表皮生長(zhǎng)面積為(16.43±4.14)，對(duì)照組為(21.09±3.740)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異p＜0.05。倍他米松戊酸酯組新生表皮厚度為(43.69±9.29)，對(duì)照組為(57.85±12.42)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異p＜0.05。倍他米松戊酸酯組新生表皮細(xì)胞層數(shù)(5.92±1.03)，對(duì)照組為(7.17±1.28)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異p＜0.05。倍他米松戊酸酯組新生表皮突增殖指數(shù)為(1.031±0.15)，對(duì)照組為(1.3±0.33)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異p＜0.05。倍他米松戊酸酯組新生表皮增殖細(xì)胞密度為(29.57±6.08)，對(duì)照組為(36.05±3.17)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異p＜0.01。 結(jié)論 1、去表皮的真皮組織為富含膠原的三維結(jié)構(gòu)，其表面保留基底膜某些蛋白成分，是一種天然真皮替代物，能夠誘導(dǎo)表皮的發(fā)育和分化。 2、在去表皮的真皮組織上發(fā)育和分化的新生表皮表現(xiàn)人體表皮的結(jié)構(gòu)特征，有基底層、棘層、顆粒層及角質(zhì)層。在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞間存在橋粒結(jié)構(gòu)。在基底膜的表皮側(cè)存在半橋粒結(jié)構(gòu)。 3、新生表皮表達(dá)角質(zhì)形成細(xì)胞分化蛋白標(biāo)志如K1，K14，包膜蛋白，與表皮發(fā)育有關(guān)的重要蛋白分子如TGase 1，β1-整合素以及組織細(xì)胞增殖標(biāo)記物如Ki67抗原，Brdu陽(yáng)性細(xì)胞，Hoechst33258。 4、用細(xì)胞熒光素FDA及CMFDA結(jié)合熒光顯微鏡和計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)，熒光定量檢測(cè)表皮生長(zhǎng)面積。 5、該模型提供了模擬在體皮膚損傷修復(fù)過程，即皮瓣邊緣角質(zhì)形成細(xì)胞分裂增殖，向真皮替代物(DED)表面移行，最后覆蓋DED，新生表皮完成修復(fù)和重塑的過程。 6、表皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)表皮的增殖，移行和修復(fù)，較高濃度的倍他米松戊酸酯抑制表皮增殖。
【圖文】：

1、DED表面存在基底膜帶 (basementmembranezone，BMZ):經(jīng)PAS染色，可見在凹凸不平的DED表面存在一條紫紅色帶，顯示PAS反應(yīng)陽(yáng)性。說明DED的表面含有較多量的中性粘多糖。(見圖1)。用免疫組化的方法顯示在DED相同部位有1V膠原的著色(見圖2)。說明DED的表面存在基底膜蛋白成分。

在DED表面有IV膠原的均勻著色(IV膠原免疫組化，ABC染色x100)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 沈丹蓓,夏隆慶;角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用的進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè);2000年02期

2 陸洪光;;面部糖皮質(zhì)激素依賴性皮炎[J];臨床皮膚科雜志;2006年10期

本文編號(hào)：2534779