【摘要】： 一、前言 移植排斥反應(yīng)是導(dǎo)致臨床同種移植術(shù)失敗的主要原因。一般認(rèn)為，T細(xì)胞應(yīng)答及其效應(yīng)是介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)發(fā)生的主要機(jī)制。雙信號假說認(rèn)為T細(xì)胞活化需兩個信號：信號1由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物(p-MHC)所啟動；信號2由T細(xì)胞和APC間共刺激分子的相互作用所啟動。兩個信號的整合可最有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，而缺乏共刺激信號可致T細(xì)胞應(yīng)答下降，某些情況下可誘導(dǎo)耐受或T細(xì)胞失能(anergy)。 近年來，對共信號分子(co-signalling molecule)的研究不斷深入，并對雙信號學(xué)說形成挑戰(zhàn)。Chen Lieping提出T細(xì)胞活化的共信號網(wǎng)絡(luò)學(xué)說，其要點是：雖然TCR信號是T細(xì)胞活化所必需，但并不能決定T細(xì)胞活化的方向，而共信號(共刺激信號和/或共抑制信號)才是引導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵。根據(jù)該理論，阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號或增強共抑制信號，均可負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。 抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)介導(dǎo)的抗原提呈是T細(xì)胞識別同種抗原的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)成熟狀態(tài)在T細(xì)胞識別同種抗原中起重要作用，并直接影響免疫應(yīng)答的強度和類型：成熟DC表面表達(dá)多種共刺激分子(如CD80、CD86、CD40等)、黏附分子(如CD54、CD58等)和MHCⅠ和Ⅱ類分子，，其功能主要是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答；未成熟DC低表達(dá)共刺激分子、黏附分子和MHC分子，其誘導(dǎo)T細(xì)胞激活的能力很弱，可能在免疫耐受形成中發(fā)揮重要作用。 CD83屬免疫球蛋白超家族，與B7家族成員具有一定同源性，是成熟DC的表面標(biāo)志，其生物學(xué)功能尚未完全清楚。已發(fā)現(xiàn)，伴隨DC成熟，其表面CD83與其他共刺激分子(CD80、CD86)的表達(dá)亦升高，提示CD83具有重要生物學(xué)功能。文獻(xiàn)報道，CD83在T細(xì)胞成熟和活化中起重要作用，其實驗依據(jù)為：①可溶性CD83可抑制T細(xì)胞活化，提示CD83可能是參與T細(xì)胞活化的共刺激分子之一；②可溶性CD83可抑制DC表達(dá)共刺激分子，并下調(diào)DC的共刺激活性，從而抑制DC對T細(xì)胞的活化。 BTLA(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是最近發(fā)現(xiàn)的CD28家族成員，與該家族另兩個抑制性受體(CTLA4、PD1)有相似分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，BTLA參與維持自身耐受，并是下調(diào)Th1細(xì)胞活性的重要因子，相關(guān)實驗依據(jù)為：①BTLA主要表達(dá)于活化的T和B細(xì)胞表面，尤其持續(xù)高表達(dá)于Th1細(xì)胞表面；②BTLA缺陷動物易誘發(fā)EAE。最近發(fā)現(xiàn)，“皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)”(herpesvirus entry mediator，HVEM)是BTLA的配體，BTLA結(jié)合HVEM的部位與LIGHT不同，但與皰疹病毒糖蛋白D(Herpesvirus glycoprotein D，gD)的結(jié)合部位相重疊。已證實，HVEM與T細(xì)胞表面BTLA結(jié)合，可啟動正向信號而抑制T細(xì)胞活化，其機(jī)制尚不清楚。有關(guān)HVEM-BTLA途徑介導(dǎo)反向信號對HVEM表達(dá)細(xì)胞的影響，迄今尚未見報道。 鑒于可溶性CD83具有抑制T細(xì)胞增殖和抑制DC共刺激活性的雙重作用，本課題探討可溶性CD83延長同種皮膚移植物存活的作用，并初步探討其機(jī)制，以期為將CD83應(yīng)用于臨床治療移植排斥反應(yīng)提供理論和實驗依據(jù)。 另外，本研究克隆小鼠BTLA基因，探討HVEM-BTLA反向信號對DC表達(dá)共刺激分子的影響，為將BTLA作為抗移植排斥反應(yīng)的分子靶點提供理論和實驗依據(jù)。 二、小鼠CD83、BTLA和人IgG1αFc基因克隆和真核表達(dá)載體構(gòu)建 采用TRIzol試劑提取小鼠脾臟和人外周血單個核細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增小鼠CD83和BTLA基因以及人IgGlαFc(hIg)基因，并克隆至pcDNA3.1(+)載體中。構(gòu)建pmCD83-hIg和pmBTLA-hIg表達(dá)載體，經(jīng)酶切和DNA序列測定鑒定，結(jié)果表明：成功克隆了小鼠CD83、BTLA胞外功能區(qū)基因和hIg基因，成功構(gòu)建了表達(dá)小鼠CD83或BTLA胞外功能區(qū)與人IgGlαFc融合蛋白(mCD83-hIg或mBTLA-hIg)的真核表達(dá)載體。 三、可溶性mCD83-hIg的制備及生物學(xué)功能的研究 采用Lipofectamine ~(TM)2000將pmCD83-hIg載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，在COS-7細(xì)胞中表達(dá)可溶性mCD83-hIg融合蛋白；采用Western blot、ELISA檢測COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清中所表達(dá)的mCD83-hIg融合蛋白，并用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品對mCD83-hIg進(jìn)行定量檢測；采用RT-PCR檢測mCD83-hIg融合基因mRNA表達(dá)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染pmCD83-hIg的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液可與抗小鼠CD83抗體形成明顯條帶，其分子量約39.8kD，與預(yù)期結(jié)果相一致；轉(zhuǎn)染后前4天細(xì)胞培養(yǎng)上清中融合蛋白表達(dá)量增高較快，但5～7天僅有輕度增高，最高達(dá)380μg/L；轉(zhuǎn)染pmCD83-hIg的COS-7細(xì)胞可表達(dá)mCD83-hIg融合基因mRNA，在約120bp處呈現(xiàn)一明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。 采集轉(zhuǎn)染pmCD83-hIg的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液，借助Protein A shepharose CL-4B親和層析柱純化mCD83-hIg融合蛋白；經(jīng)濃縮透析，借助SDS-PAGE鑒定融合蛋白純度，純化的融合蛋白在約39.8kD處形成一條帶，提示純化蛋白純度較高，可用于后續(xù)實驗研究。 借助倒置顯微鏡觀察小鼠DC細(xì)胞系(DC2.4)形態(tài)；FCM鑒定其表面標(biāo)志。結(jié)果顯示：DC2.4呈典型樹突狀細(xì)胞形態(tài)，表面高表達(dá)CD83、CD80和CD86，表明DC2.4為成熟的小鼠DC，可作為DC研究的細(xì)胞模型。 將mCD83-hIg加入到DC2.4培養(yǎng)體系中，72小時后應(yīng)用PI染色，F(xiàn)CM檢測DC細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，并檢測DC表面共刺激分子表達(dá)、IL-12產(chǎn)生及其刺激同種T細(xì)胞活化的能力。結(jié)果顯示：mCD83-hIg對DC2.4細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡無影響，但可下調(diào)CD83、CD80和CD86表達(dá)，顯著抑制LPS刺激的IL-12產(chǎn)生，并顯著抑制DC2.4的共刺激活性。 分離BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，C57BL/6小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，進(jìn)行單向MLR，以檢測mCD83-hIg對同種T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mCD83-hIg可顯著抑制T細(xì)胞增殖，抑制IL-2和IFN-γ產(chǎn)生，并呈劑量依賴性，但對IL-4和IL-10產(chǎn)生無影響。 以上結(jié)果說明：可溶性mCD83-hIg可抑制DC表面共刺激分子表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的IL-12產(chǎn)生，從而抑制DC的共刺激活性；可溶性mCD83-hIg也可抑制T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生IL-2、IFN-γ。因此，可溶性CD83可分別作用于DC和T細(xì)胞，從而對T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用。 四、mCD83-hIg延長同種皮膚移植物存活時間的實驗研究 建立小鼠同種皮膚移植模型。在皮膚移植前1天、移植后第1天和第3天，分別用可溶性mCD83-hIg處理皮膚移植受者，觀察皮膚移植物存活時間，并以人IgG和PBS作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mCD83-hIg處理組移植物平均存活時間為(12.57±2.07)天，人IgG對照組為(8.57±1.51)天，PBS對照組為(8.71±1.11)天，mCD83-hIg處理組皮膚移植物存活時間顯著長于對照組(P＜0.01)。 移植后第7天，取移植皮片進(jìn)行組織學(xué)分析，并借助RT-PCR檢測某些細(xì)胞因子mRNA表達(dá)；取受者外周血檢測血清某些細(xì)胞因子水平；取供者脾細(xì)胞再次刺激受者脾臟T細(xì)胞，檢測后者對供者同種抗原的再次應(yīng)答能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①mCD83-hIg處理組皮膚移植物中炎性浸潤明顯低于對照組，對照組皮膚移植物中有較多炎性細(xì)胞浸潤，主要為單個核細(xì)胞，且毛細(xì)血管嚴(yán)重充血，出血，組織出現(xiàn)小潰瘍灶；②mCD83-hIg處理組皮膚移植物中炎性細(xì)胞因子IL-2和IFN-γmRNA表達(dá)顯著低于對照組(P＜0.01或P＜0.05)，但各組間IL-4和IL-10mRNA表達(dá)無差異；③mCD83-hIg處理組受者血清IL-2和IFN-γ水平也顯著低于對照組(P＜0.01)，各組間血清IL-4和IL-10水平亦無有差異；④mCD83-hIg處理組受者脾臟T細(xì)胞對供者脾細(xì)胞再刺激的增殖活性顯著低于對照組。 以上研究結(jié)果表明：可溶性CD83在體內(nèi)可抑制同種T細(xì)胞活化，抑制Th1型細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而延長同種皮膚移植物存活。提示：可溶性CD83在治療移植排斥反應(yīng)中可能具有較好應(yīng)用前景。 五、重組GST-mBTLA融合蛋白的表達(dá)及抗血清的制備 構(gòu)建谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶—小鼠BTLA胞外功能區(qū)融合基因(GST-mBTLA)的重組質(zhì)粒：在E．coli BL21(DE3)中表達(dá)重組GST-mBTLA融合蛋白；借助Glutathione Sepharose 4B親和層析柱純化重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，純化的重組蛋白達(dá)到電泳純；將重組蛋白免疫家兔，制備兔抗GST-mBTLA血清，其雙擴(kuò)散效價為1：16，ELISA效價為1：3200。 六、可溶性mBTLA對DC表面共刺激分子表達(dá)的影響 將pmBTLA-hIg載體轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。采用Western blot、ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中mBTLA-hIg融合蛋白含量，并用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測mBTLA-hIg；借助RT-PCR檢測mBTLA-hIg融合基因mRNA表達(dá)。結(jié)果表明：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pmCD83-hIg的DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液可與抗mBTLA抗體形成明顯條帶，其分子量約43.3kD，與預(yù)期結(jié)果相一致：1×10~4pmBTLA-hIg穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DC2.4，(在2.5ml培養(yǎng)基中)所分泌mBTLA-hIg融合蛋白水平呈時間依賴性，最高達(dá)230ug/L；借助RT-PCR，證明轉(zhuǎn)染pmBTLA-hIg的DC2.4可表達(dá)mBTLA-hIg融合基因mRNA，在約175bp處呈現(xiàn)一明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。 將穩(wěn)定表達(dá)mBTLA-hIg的DC2.4培養(yǎng)72小時，經(jīng)PBS洗滌，用FITC標(biāo)記的抗人IgG1單抗染色，借助FCM檢測細(xì)胞表面是否結(jié)合mBTLA-hIg。結(jié)果表明：穩(wěn)定表達(dá)mBTLA-hIg的DC2.4能與FITC標(biāo)記的抗人IgG1抗體結(jié)合，說明mBTLA-hIg可結(jié)合到DC2.4表面；借助FCM分析穩(wěn)定表達(dá)mBTLA-hIg的DC2.4表面共刺激分子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD80表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而CD86表達(dá)低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；將GST-mBTLA融合蛋白加入未轉(zhuǎn)染DC2.4培養(yǎng)體系中，借助FCM檢測共刺激分子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GST-mBTLA融合蛋白可上調(diào)DC2.4表面CD80表達(dá)，并呈劑量依賴性，但GST-mBTLA對DC2.4表面CD86表達(dá)無影響。進(jìn)一步在DC培養(yǎng)體系中加入兔抗小鼠GST-mBTLA血清，檢測抗血清的阻斷效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：可溶性mBTLA對DC表面共刺激分子表達(dá)的影響可被兔抗小鼠GST-mBTLA血清所阻斷。 上述結(jié)果說明：可溶性mBTLA可調(diào)節(jié)DC表面共刺激分子表達(dá)，即可調(diào)節(jié)DC的共刺激活性，該效應(yīng)可能是HVEM-BTLA反向信號作用于DC的結(jié)果。進(jìn)一步研究BTLA對DC生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，不僅具有重要理論意義，也可望為探尋干預(yù)免疫相關(guān)疾病的策略提供理論和實驗依據(jù)。 七結(jié)論 1．可溶性CD83的生物學(xué)效應(yīng)為：①下調(diào)DC表面共刺激分子表達(dá)和IL-12產(chǎn)生，從而抑制DC的共刺激活性；②通過抑制T細(xì)胞增殖、Th1型細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而在DC和T細(xì)胞兩個調(diào)節(jié)點對免疫應(yīng)答起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 2．給予可溶性mCD83-hIg可延長小鼠同種皮膚移植物存活時間，提示其可能是一種有效的免疫抑制劑，并可望在治療移植排斥反應(yīng)和自身免疫病中具有應(yīng)用前景。 3．可溶性mBTLA可調(diào)節(jié)DC表面共刺激分子表達(dá)，該效應(yīng)可能是HVEM-BTLA途徑反向信號作用的結(jié)果。
【圖文】：

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文見圖1一5一8，mcD83ext插入PcDNA3.1一hlg后采用T7和sP6通用引物測序，證明mCD83的序列與Genebank中所公布序列完全一致 (NM009856)。ABbpbpp皿b加1000750500 111069715000100007弓00500025001000413250圖1一 4mCD83基因克隆和pmCn83一hlg載體構(gòu)建Figl一 3AmPlificationofmurineCD83genebyRT一 PCRandconstruetionofPmCD83一 hlgreeombinantveetor A:eDNAofmurineCD83amPlifiedfrommousesPleenbyRT-PCR.PCRProduetionofmurine CD83wasan806bPfragement.B:IdeniificationofPmCD83一 hlgreeombinantveetorbythe restrictionendonucleasedigestion.l:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlllonly;2:PmCD83一hlg digestedbyHindlll/B翩Hl， releasea413bPfragementofCD83ext:3:PmCD83一hlgdigestedbyBamHI/Xbal， releasea697bPfragmentofhlgFe;4:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlll/乃al， releasea1110bPfragmentofmB7h3一 hlg;M:DNAmarker.

2.采用PCR技術(shù)自pGEMT-mBTLA質(zhì)粒中擴(kuò)增 mcD83extDNA，并克隆至PcDNA3.1一Mg載體的hlg上游，分別經(jīng)Hin班Il/B“mHI、B“mHI/乃clI和Hindlll/乃aI雙酶切鑒定，結(jié)果酶切片斷大小和預(yù)期結(jié)果一致(圖1一9一B)。序列測定結(jié)果顯示，克隆的mBTLA序列與Geneballk中所登錄的小鼠BTLA序列(AY293285)完全一致(圖1一10)。ABBTLA五任 1234MbP9171000500圖1一 9mBTLA基因克隆和載體構(gòu)建鑒定Figl一 9AmPlifieationofxnouseBTLAgenebyRT一 PCRandconstructionofPmBTLA一 hlgrecombinantvector A:cDNAofmouseBTLAamplifiedfrommousesPlenieeellsbyRl’ -PCR， BTLA:PCRProduction ofmouseBTLA;M:DL20OODNAmarker.B:IdentifieationofPmBTLA一 hlgrecombinantveetor bytherestrietionendonueleasedigestion.1:PmBTLA一 hlgdigestedby關(guān)刀力 dlllonly;2:PmBTLA一 hlgdigestedbyHin班11/乃al， releasingafragmentof1228bPcontainingBTLAand hlgFe:3:PmBTLA一 hlgdigestedbyBamHI/乃al， releasingafragmentof697bPofhlgFc:4:PmBTLA一 hlgdigestedbyHindlll/BamHIreleasingafragmentof531bPofB丁’LA;M:DNA markerIV‘
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R622;R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李坤;人可溶性CD83基因的克隆、原核表達(dá)、純化及其融合蛋白活性檢測[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

本文編號：2534654