【摘要】：增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand, APRIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一,全長為250 個氨基酸,屬Ⅱ型跨膜蛋白,通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。近年研究表明,APRIL 密切參與了促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、延長惡性腫瘤細(xì)胞存活及加速腫瘤形成等多個過程。因此,該分子有望成為多種惡性腫瘤治療時進(jìn)行藥物設(shè)計的新靶點,設(shè)法有效抑制APRIL 的功能活性,將有可能為相關(guān)腫瘤的治療提供嶄新途徑。為此我們克隆和表達(dá)了重組人可溶性APRIL(soluble APRIL,sAPRIL)分子,在與TALL-1 ( TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1,又稱BLyS 或BAFF ) 同源序列比對基礎(chǔ)上進(jìn)行突變位點設(shè)計,借助一步反向PCR 致突變法構(gòu)建人sAPRIL cDNA 的兩個突變體,進(jìn)而對sAPRIL 及其突變體蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化及生物學(xué)活性檢測。取得的主要結(jié)果如下: 1. 經(jīng)RT-PCR 成功地克隆了編碼人APRIL 胞外區(qū)105-250 的cDNA(即sAPRIL cDNA),經(jīng)查對,與GenBank 上登錄的編碼相應(yīng)APRIL 胞外區(qū)cDNA 的序列完全一致。 2. 以獲得的pUC19/sAPRIL 為模板,經(jīng)一步反向PCR 法成功構(gòu)建了缺失編碼第187 位谷氨酰胺的CAA 和以編碼甘氨酸的GGA 替換CAA 的兩個突變體cDNA,分別命名為pUC19/msAPRIL1 和pUC19/msAPRIL2。 3. 將上述測序正確的野生型和突變型目的片段分別連接于原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L,成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/sAPRIL、pQE-80L/msAPRIL1 和pQE-80L/msAPRIL2。 4. 將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)IPTG 誘導(dǎo),均獲得了較高水平的表達(dá),并確立sAPRIL 及其突變體msAPRIL 1、msAPRIL 2 在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件均為終濃度1mmol/L 的IPTG 在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。SDS-PAGE 分析可見,各重組蛋白的大小均約為19kDa,主要是以包涵體的形式存在。Western blotting分析顯示,各目的蛋白均在分子量約19kDa 處出現(xiàn)單一條帶。 5. 經(jīng)Ni~(2+)-NTA 純化系統(tǒng)及尿素透析,各重組蛋白得到了有效純化和復(fù)性。純化蛋白在SDS-PAGE 上呈現(xiàn)單一條帶。 6. 生物學(xué)活性分析顯示,所制備的重組人sAPRIL 有明顯促進(jìn)人A549 肺癌細(xì)胞
【圖文】：

質(zhì)粒 pUC19/ sAPRIL 由第一部分實驗獲得；一步反向 PCMutanBest Kit)購自大連 TaKaRa 公司，其余原核表達(dá)載體構(gòu)建化及復(fù)性等所需試劑和儀器同第一部分。方 法 sAPRIL 不同突變體 cDNA 的獲得引物的設(shè)計與合成 針對 sAPRIL 第 187 位氨基酸設(shè)計突變氨酰胺（msAPRIL1）；②以一個甘氨酸替換第 187 位谷氨酰胺（，在待突變部位的兩側(cè)沿相反方向設(shè)計一對引物，針對 msA使上游或下游引物 5' 端的起點向相應(yīng)引物的 3'端移動待缺失單純置換突變），則將擬用作置換的序列直接設(shè)計在上游或下2) 。

染色可見細(xì)胞核，證實該陰性對照的可信性(參見照片 20、21、22、23)。在免疫熒光顯微鏡下觀察可見：A549 細(xì)胞呈現(xiàn)多形性，核仁多個且不規(guī)則；用sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 孵育的 A549 細(xì)胞胞膜、胞漿呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光；用sAPRIL 蛋白孵育的 A549 細(xì)胞還在核膜和核內(nèi)顯示出特異的高強(qiáng)度熒光。用 PBS 及相同蛋白濃度 DHFR 孵育的細(xì)胞則僅可觀察到少許非特異性熒光雜質(zhì)(參見照片 24、25、26、27、28)。2. 各重組蛋白與 Jurkat 淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)合情況流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，用 sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 作用于 Jurkat 細(xì)胞后檢測其平均熒光強(qiáng)度分別為 91.55、71.52 和 109.44，而對照組中用同樣方法純化的 DHFR處理的 Jurkat 細(xì)胞熒光強(qiáng)度僅為 39.41，與用 PBS 處理的 Jurkat 細(xì)胞相當(dāng)(各組平均熒光強(qiáng)度為 31.90、34.05、34.25、36.97)。經(jīng)換算成熒光系數(shù)后， msAPRIL1 的熒光系數(shù)為1.09，，說明其與 Jurkat 細(xì)胞具有中等結(jié)合力；sAPRIL 的熒光系數(shù)為 1.69，說明其與 Jurkat細(xì)胞結(jié)合力高，而 msAPRIL2 的熒光系數(shù)為 1.96，說明其與 Jurkat 細(xì)胞結(jié)合力最高(圖 7、8、9、10，表 1)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R346

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本文編號：2532033