【摘要】：增殖誘導配體(a proliferation-inducing ligand, APRIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的新成員之一,全長為250 個氨基酸,屬Ⅱ型跨膜蛋白,通過與其受體結合而發(fā)揮生物學作用。近年研究表明,APRIL 密切參與了促進多種惡性腫瘤細胞增殖、延長惡性腫瘤細胞存活及加速腫瘤形成等多個過程。因此,該分子有望成為多種惡性腫瘤治療時進行藥物設計的新靶點,設法有效抑制APRIL 的功能活性,將有可能為相關腫瘤的治療提供嶄新途徑。為此我們克隆和表達了重組人可溶性APRIL(soluble APRIL,sAPRIL)分子,在與TALL-1 ( TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1,又稱BLyS 或BAFF ) 同源序列比對基礎上進行突變位點設計,借助一步反向PCR 致突變法構建人sAPRIL cDNA 的兩個突變體,進而對sAPRIL 及其突變體蛋白進行表達、純化及生物學活性檢測。取得的主要結果如下: 1. 經(jīng)RT-PCR 成功地克隆了編碼人APRIL 胞外區(qū)105-250 的cDNA(即sAPRIL cDNA),經(jīng)查對,與GenBank 上登錄的編碼相應APRIL 胞外區(qū)cDNA 的序列完全一致。 2. 以獲得的pUC19/sAPRIL 為模板,經(jīng)一步反向PCR 法成功構建了缺失編碼第187 位谷氨酰胺的CAA 和以編碼甘氨酸的GGA 替換CAA 的兩個突變體cDNA,分別命名為pUC19/msAPRIL1 和pUC19/msAPRIL2。 3. 將上述測序正確的野生型和突變型目的片段分別連接于原核表達質粒pQE-80L,成功地構建了重組原核表達質粒pQE-80L/sAPRIL、pQE-80L/msAPRIL1 和pQE-80L/msAPRIL2。 4. 將上述質粒分別轉化大腸桿菌DH5α,經(jīng)IPTG 誘導,均獲得了較高水平的表達,并確立sAPRIL 及其突變體msAPRIL 1、msAPRIL 2 在大腸桿菌中高效表達的最佳誘導表達條件均為終濃度1mmol/L 的IPTG 在37℃誘導表達4h。SDS-PAGE 分析可見,各重組蛋白的大小均約為19kDa,主要是以包涵體的形式存在。Western blotting分析顯示,各目的蛋白均在分子量約19kDa 處出現(xiàn)單一條帶。 5. 經(jīng)Ni~(2+)-NTA 純化系統(tǒng)及尿素透析,各重組蛋白得到了有效純化和復性。純化蛋白在SDS-PAGE 上呈現(xiàn)單一條帶。 6. 生物學活性分析顯示,所制備的重組人sAPRIL 有明顯促進人A549 肺癌細胞
【圖文】：

質粒 pUC19/ sAPRIL 由第一部分實驗獲得；一步反向 PCMutanBest Kit)購自大連 TaKaRa 公司，其余原核表達載體構建化及復性等所需試劑和儀器同第一部分。方 法 sAPRIL 不同突變體 cDNA 的獲得引物的設計與合成 針對 sAPRIL 第 187 位氨基酸設計突變氨酰胺（msAPRIL1）；②以一個甘氨酸替換第 187 位谷氨酰胺（，在待突變部位的兩側沿相反方向設計一對引物，針對 msA使上游或下游引物 5' 端的起點向相應引物的 3'端移動待缺失單純置換突變），則將擬用作置換的序列直接設計在上游或下2) 。

染色可見細胞核，證實該陰性對照的可信性(參見照片 20、21、22、23)。在免疫熒光顯微鏡下觀察可見：A549 細胞呈現(xiàn)多形性，核仁多個且不規(guī)則；用sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 孵育的 A549 細胞胞膜、胞漿呈現(xiàn)較強熒光；用sAPRIL 蛋白孵育的 A549 細胞還在核膜和核內顯示出特異的高強度熒光。用 PBS 及相同蛋白濃度 DHFR 孵育的細胞則僅可觀察到少許非特異性熒光雜質(參見照片 24、25、26、27、28)。2. 各重組蛋白與 Jurkat 淋巴瘤細胞的結合情況流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，用 sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 作用于 Jurkat 細胞后檢測其平均熒光強度分別為 91.55、71.52 和 109.44，而對照組中用同樣方法純化的 DHFR處理的 Jurkat 細胞熒光強度僅為 39.41，與用 PBS 處理的 Jurkat 細胞相當(各組平均熒光強度為 31.90、34.05、34.25、36.97)。經(jīng)換算成熒光系數(shù)后， msAPRIL1 的熒光系數(shù)為1.09，，說明其與 Jurkat 細胞具有中等結合力；sAPRIL 的熒光系數(shù)為 1.69，說明其與 Jurkat細胞結合力高，而 msAPRIL2 的熒光系數(shù)為 1.96，說明其與 Jurkat 細胞結合力最高(圖 7、8、9、10，表 1)。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R346

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本文編號：2532033