【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是指一群具有向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的多潛能組織干細(xì)胞。MSCs不僅存在于骨髓,也存在于臍血和外周血中。與骨髓相比,臍血來(lái)源更為充足,免疫原性更弱,能耐受更大程度的HLA配型不符。但是臍血中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量較低,擴(kuò)增困難,對(duì)于臨床的應(yīng)用是很大的阻礙。因此我們?cè)噲D在臍血原代培養(yǎng)和純化的基礎(chǔ)上,通過(guò)導(dǎo)入基因的方法,延長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期,為組織工程學(xué)打下基礎(chǔ)。 延長(zhǎng)細(xì)胞壽命甚至使細(xì)胞達(dá)到永生化的方法有很多,目前發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)可以激活細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性,該酶可使端粒長(zhǎng)度保持恒定從而極大的擴(kuò)張細(xì)胞的增殖能力,我們?cè)O(shè)想將外源性hTERT基因轉(zhuǎn)入正常的細(xì)胞中,有可能激活端粒酶使細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),不易衰老甚至有可能超越細(xì)胞增殖的危機(jī)獲得永生化。 然而問(wèn)題是怎么把hTERT基因轉(zhuǎn)入正常的細(xì)胞中?目前轉(zhuǎn)基因的方法有很多包括病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒等;非病毒載體如陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法、鈣離子沉淀法、電穿孔法等。方法不同,轉(zhuǎn)化效率不同。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等效率很低,而逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體有比較高的轉(zhuǎn)染效率,但腺病毒介導(dǎo)的外源性基因表達(dá)是暫時(shí)的,因?yàn)橄俨《綝NA通常不能整合入細(xì)胞基因組。逆轉(zhuǎn)錄病毒能使目的基因穩(wěn)定地整合于靶細(xì)胞的染色體,最終實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移,可以廣泛用于高效的單一或多基因的轉(zhuǎn)導(dǎo),例如各種類型的原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等。目前用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為轉(zhuǎn)基因的載體是最常用,效率比較高而且相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。
【圖文】：

2005年碩士學(xué)位論文hTERT一逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建及其介導(dǎo)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移結(jié)果CMSCs的培養(yǎng):本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)了52份臍血，有14份長(zhǎng)出了梭形細(xì)胞，描述的25%相同，而能夠達(dá)到融合傳代的有六份，約n%。置顯微鏡下觀察:培養(yǎng)初期(24卜72h)UBCMSCs胞體小，細(xì)胞在培分布，呈圓形，培養(yǎng)物中造血細(xì)胞成分居多，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這逐漸壞死破碎，隨換液次數(shù)的增多而清除。原代細(xì)胞培養(yǎng)72h換液后，貼壁細(xì)胞，此時(shí)貼壁的細(xì)胞為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的克隆，細(xì)胞則呈三角，，有粗大突起伸出，以后逐漸變?yōu)闄E圓，胞體變大，向兩極伸出突起，此生長(zhǎng)過(guò)程大約為d7，傳代后，細(xì)胞變純，形態(tài)不規(guī)則體積較大的細(xì)亡，以梭形為主，見(jiàn)圖1。

感受態(tài)細(xì)菌JM109中，挑選出具有氨卞抗性的細(xì)菌克隆八個(gè)，經(jīng)Bgln和Notl雙酶切，瓊脂糖電泳篩選，所選的質(zhì)粒酶切圖譜為6.Ikb和3.6kb兩個(gè)片段，證明構(gòu)建成功見(jiàn)圖2。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒的單酶切和雙酶切圖譜見(jiàn)圖3。圖Zh花RT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的篩選:左一>右，marker，目的質(zhì)粒，非目的質(zhì)粒1，非目的2圖3左一>右雙酶切，單酶切，marker2.2選責(zé)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)并持續(xù)表達(dá)hTERT的抗性克隆:用G418濃度為lo00m留L篩選d7后包裝細(xì)胞大部分死亡，死亡細(xì)胞變?yōu)閳A形，并逐漸脫落，Zw后長(zhǎng)出克隆，待細(xì)胞克隆長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)將細(xì)胞克隆消化后擴(kuò)大培養(yǎng)，挑出四個(gè)細(xì)胞克隆測(cè)病毒滴度，見(jiàn)圖4A一B。2.3病毒滴度的測(cè)定:將病毒上清感染NIH3T3細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2531940