【摘要】：卵透明帶是當今生殖研究中的一個熱點,但天然卵透明帶的來源稀缺影響了對它的研究和應用。分子生物學研究者利用基因工程技術(shù)重組人卵透明帶蛋白及其肽段,以期為生殖研究帶來新的前景。本研究通過兩方面的實驗——頂體誘發(fā)實驗以及精卵結(jié)合實驗來測試重組人卵透明帶蛋白3(Recombinant Zona Pellucida Protein-3,rhZP3)的生物活性,為以后的抗生育和不育診斷試劑研究提供初步依據(jù)。 分別用空白培養(yǎng)液,含孕酮的培養(yǎng)液以及含有不同濃度的rhZP3的培養(yǎng)液對人精子進行頂體誘發(fā)實驗,并且用考馬斯亮藍染色法對頂體狀態(tài)進行評價。精卵結(jié)合實驗分兩部分進行:用不同濃度的rhZP3以及空白培養(yǎng)液分別處理同一份精子,然后再與卵子進行結(jié)合實驗,觀察經(jīng)過不同處理的精子在精卵結(jié)合中的情況;另一方面,用分離提純的rhZP3免疫新西蘭大白兔,制備抗血清,用不同濃度的rhZP3抗血清與陰性血清分別處理來源相同的卵子,再各自與同一份精子進行結(jié)合實驗,觀察經(jīng)過不同處理后的卵子在精卵結(jié)合中的情況。由于人卵來源的限制,本研究采用了小鼠作為輔助研究模型來探討rhZP3對精卵結(jié)合的影響。同時利用免疫組織化學技術(shù),用正常人卵巢切片與rhZP3抗血清進行反應,觀察rhZP3抗血清對卵巢的影響。 研究結(jié)果表明,在rhZP3誘發(fā)頂體反應實驗中,rhZP3處理組與空白對照組之間差異顯著(P0.05),而且項體發(fā)生率隨rhZP3濃度的增加而升高。初步證實rhZP3能誘發(fā)人精子發(fā)生頂體反應,并且在一定濃度范圍內(nèi)頂體發(fā)生率與濃度成正相關(guān)。精卵結(jié)合實驗結(jié)果顯示各實驗組和對照組之間存在顯著性差異(P0.05)。rhZP3和rhZP3抗體能夠在一定濃度內(nèi)抑制人和小鼠的精卵結(jié)合,且這種抑制程度是隨著濃度的增大而增加的。在同樣的實驗中,rhZP3以及抗rhZP3抗體對人類精卵結(jié)合的抑制明顯大于對小鼠精卵結(jié)合的抑制。免疫組織化學結(jié)果顯示,抗體與卵巢組織切片顯示出弱陽性。 實驗的結(jié)果可初步推斷rhZP3具有天然卵透明帶相似的活性,其抗血清與卵巢反應性很低,為以后發(fā)展不孕不育檢測試劑和避孕疫苗提供了體外實驗的證據(jù)。
【圖文】：

3.1.2hrPz3抗血清免疫組化檢測結(jié)果當ELISA滴度為:l犯oo時，常規(guī)間接法(采用原血清)實驗結(jié)果呈陰性，當EuSA滴度達到1:12800時，采用SABC法(采用原血清)，卵巢切片可見弱陽性。見圖1。圖1正常人卵巢透明帶免疫組化sABc法、400A.陰性對照血清免疫組化結(jié)果:ZP未著色BhtZP3抗血清免疫組化結(jié)果:zP被染成淺棕色

少量精子頂體后區(qū)也呈紫藍色;B型為已發(fā)生頂體反應的精子，頂體區(qū)不染色或染淺紫色，其余部位染色與A型相似。兩類精子的根本差別是頂體區(qū)是否染成紫藍色。見圖2圖2精子涂片觀察(xl000)表1rhZP3對精子頂體反應的誘導結(jié)果頂體發(fā)生率組別處理條件(x士s，%)空白陽性含BSA的BWW培養(yǎng)液孕酮(lug/ml)+含BsA的BWW培養(yǎng)液4.33士3.2181.33士3.06rZhp3htzp3(soug/ml)+含BsA的BWW培養(yǎng)液960.00士8.54注:*與其他組相比，P<0.05
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R321

【共引文獻】

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本文編號：2531845