【摘要】： 目的:構(gòu)建由噬菌體展示的免疫球蛋白結(jié)合蛋白Protein A的定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫(kù),并應(yīng)用各種類型免疫球蛋白對(duì)該組合文庫(kù)進(jìn)行體外親和篩選,以獲得各種具有不同結(jié)合特性的新的Ig結(jié)合分子結(jié)構(gòu),同時(shí)也為研究Ig與Ig結(jié)合分子相互作用的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法:應(yīng)用Overlap PCR的方法制備Protein A的Z結(jié)構(gòu)域(Protein A-Z),克隆于pMD-18T載體構(gòu)建PA-Z/pMD-18T重組質(zhì)粒。并應(yīng)用含隨機(jī)核苷酸序列(NNS)的引物,通過Overlap PCR方法制備對(duì)Protein A-Z的第10、13、27、28、31和32位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變的定點(diǎn)隨機(jī)突變體片段。在突變體片段的3′端引入3個(gè)氨基酸大小(NNS)的隨機(jī)連接肽,將片段隨機(jī)連接,克隆于噬菌粒展示載體pCANTAB5S,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1后輔助噬菌體M13K07拯救,構(gòu)建由噬菌體展示的Protein A-Z定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫(kù)。測(cè)定庫(kù)容量、滴度,挑取單克隆進(jìn)行序列測(cè)定,評(píng)價(jià)文庫(kù)的隨機(jī)性。應(yīng)用人IgG、IgA分別對(duì)該噬菌體文庫(kù)進(jìn)行4輪體外親和篩選,結(jié)合實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)篩選親和力的變化,PCR法監(jiān)測(cè)篩選過程中各不同數(shù)目結(jié)構(gòu)域組成的變化。 結(jié)果:獲得了庫(kù)容量為2.4×107,滴度為1.4×1012 TU/ml的噬菌體展示Protein A-Z定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫(kù),經(jīng)測(cè)定該庫(kù)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上具有較好的隨機(jī)性和多樣性。但在IgG、IgA親和篩選過程中未獲得陽性結(jié)合分子。 結(jié)論:對(duì)Protein A-Z的6位氨基酸隨機(jī)突變并引入3個(gè)氨基酸大小隨機(jī)連接肽,理論上包含的分子數(shù)目達(dá)到1010以上,為獲得各種不同的免疫球蛋白結(jié)合分子,需要更大容量的噬菌體展示文庫(kù)。但本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是對(duì)獲得各種新型高特異性高親和力Ig結(jié)合分子的一次科學(xué)的探索,同時(shí)也為噬菌體展示技術(shù)在免疫球蛋白結(jié)合分子進(jìn)化研究中的應(yīng)用提供了新的可借鑒方法。
【圖文】：

如上進(jìn)化篩選過程重復(fù) 4 輪。.2.3 各代噬菌體文庫(kù)的滴度及無菌測(cè)定 具體方法與原代文庫(kù)的滴度及無菌測(cè)定.2.4 PCR 檢測(cè)各代噬菌體文庫(kù)中不同大小展示片段的分布情況 具體方法與原大小展示片段的 PCR 檢測(cè)相同。3、實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果.1 噬菌體展示 Protein A 定點(diǎn)隨機(jī)突變體組合文庫(kù)的構(gòu)建.1. 1 PA-Z/pMD-18T 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 應(yīng)用 Overlap PCR 方法成功擴(kuò)增 Protein A，大小為 174bp，電泳檢測(cè)顯示與理論值相符（圖 1-3,1-4）。將擴(kuò)增片段回收后MD-18T 載體, 構(gòu)建 PA-Z /pMD-18T 重組質(zhì)粒。1 2 3 M 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

菌體文庫(kù)的構(gòu)建 突變體片段和 pCANTAB5S 為 183bp，電泳檢測(cè)顯示與理論值相符(圖 1-6)細(xì)胞 E.coli TG1， M13K07 輔助噬菌體拯救，化數(shù)即庫(kù)容量為 2.4×107，，滴度為 1.4×1012TU 1-5 PCR 擴(kuò)增制備含酶切位點(diǎn)和隨機(jī)連接肽序列的 PA-Z 突-5: PA-Z 突變體片段 (269bp) ; 6: PA-Z 片段(174bp); M: DL2000 M 1 2 3 41: PA-Z 突變體片2: PA-Z 突變體片3: pCANTAB5S4: pCANTAB5SM: DL2000 DNA
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

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1 周霞;噬菌體展示技術(shù)對(duì)免疫球蛋白結(jié)合分子結(jié)構(gòu)與功能的系列研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

2 盧海妹;免疫球蛋白結(jié)合分子定點(diǎn)隨機(jī)突變組合噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2530905