【摘要】：目的:克隆新發(fā)現(xiàn)的人Lamda3和Epsilon干擾素基因。目前對(duì)這兩個(gè)干擾素的研究很少,因此我們通過(guò)RT-PCR獲得這兩個(gè)干擾素的全長(zhǎng)cDNA,并重組到真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,在真核系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)并檢測(cè)表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。 方法:分別從病毒或細(xì)胞因子刺激的細(xì)胞中抽提總RNA,通過(guò)RT-PCR獲得人干擾素lamda3(hIFN-λ3)和epsilon (hIFN-ε)基因。將其重組到pcDNA3.1/myc-his(-)A真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定后,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1 A-hIFN-λ3和pcDNA3.1 A-hIFN-ε分別導(dǎo)入真核細(xì)胞COS-7或CHO細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá),研究表達(dá)產(chǎn)物的功能及生物學(xué)活性。 結(jié)果:通過(guò)PCR、酶切鑒定和測(cè)序證明成功的獲得了603bp的人hIFN-λ3和627bp的人hIFN-ε基因,且序列測(cè)定結(jié)果與GenBank報(bào)道的完全一致,真核重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。結(jié)果顯示hIFN-λ3和hIFN-ε基因不僅可在COS-7或CHO細(xì)胞中表達(dá),而且表達(dá)的rhIFN-λ3蛋白具有抗病毒活性;rhIFN-ε蛋白不僅具有抗病毒活性,還具有抗增殖活性,其抗病毒分子機(jī)理可能與誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生MxA抗病毒蛋白有關(guān),為今后干擾素的基因重組藥物研制奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論:我們成功的獲得了hIFN-λ3和hIFN-ε基因,并在真核細(xì)胞中得
【圖文】：

一l轉(zhuǎn)化平板鑒定:，，、

和EPsilno干擾素基因的克隆、表達(dá)及活性鑒定第一部分一條約600bp的亮帶，同預(yù)計(jì)的目的基因片段大小相一致(圖1一2)。圖1一2hINF一人3-TRPcR擴(kuò)增特異片段結(jié)果Fig.l一2Rl’-PCRProduetofhINF一入3cDNArfagmentl:hINF一入3rfagmnetM:DNAmarker:100bPladder2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PRc鑒定將擴(kuò)增的目的基因純化后與真核表達(dá)載體PcNDA3.1m/yc一his(一)A定向連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHS。受體菌后，挑取菌落，，抽質(zhì)粒，通過(guò)Eoc班、Bamfn雙酶切及PCR鑒定均可得到約60Obp的目的DNA條帶，說(shuō)明基因組裝方向正確，基因片段大小與預(yù)期一致，該片段可能是hIF-N人3基因(如圖一3，l一4)。圖l一3重組質(zhì)粒沐洲A3.IA扣NF·入3的雙酶切鑒定Figl一3Resrti畫onna目ysisof伴DNA3.IA.h]l刑.人3.M.ONAst田ld.勸m耐ker(D以，加O)1拼洲A3.IA一址NF一入3digesetdbyEc0RlndaB別”】112書洲A3.AIdig酬曰by枷RlnadBmal習(xí)圖l一4彭順粒體側(cè)A3JA一NF一人3的此R鑒定Figl健咒Rinde石石。山onof詳ND月.IA七FIN.人3M.DNAs細(xì)ld匆心瀏吐。(DUl0(X))P此Riden的。幣。nofpeNDA3.IA扣FN·入3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2530452