【摘要】：目的：利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)原代培養(yǎng)的優(yōu)化方法，成功構(gòu)建臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型。在此基礎(chǔ)上，以不同濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolyssacarides，LPS)和甘油三酯(Triglycerides，TG)共同干預(yù)受試細(xì)胞的生長，，觀察作用前后不同時(shí)間段靶細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和內(nèi)皮素(Endothelin，ET)的變化，并確立其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子水平的依據(jù)，從始動(dòng)環(huán)節(jié)部分闡明心腦血管性疾病的致病機(jī)制，為研發(fā)拮抗內(nèi)毒素藥物和預(yù)防心腦血管疾病提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．分別比較不同濃度的胰蛋白酶和膠原酶灌注臍靜脈、灌注消化法和機(jī)械刮除法、不同pH值的培養(yǎng)液對細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量等生長影響來優(yōu)化細(xì)胞模型的構(gòu)建，并從鏡下形態(tài)觀察和應(yīng)用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化方法對獲得細(xì)胞作出鑒定。2．原代細(xì)胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后取對數(shù)生長期的細(xì)胞作為受試細(xì)胞，用不同濃度的LPS和TG對受試細(xì)胞作用，在不同時(shí)間段收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，分別應(yīng)用~(125)I放射性核素標(biāo)記TNF和ET的抗體，對所收集的標(biāo)本進(jìn)行放射免疫(RIA)定量分析，給出各組HUVEC培養(yǎng)液中TNF和ET含量。3．按照引物合成原則并利用相關(guān)合成軟件分別設(shè)計(jì)TNF，ET引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增TNF和ET的mRNA，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外透射儀上肉眼觀察結(jié)果并攝影記錄，同時(shí)采用凝膠分析軟件測算各條帶光密度值，進(jìn)行分析比較。
【圖文】：

圖l臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鏡下觀察(x100倍)圖2姍因子相關(guān)抗原檢測鏡下觀察(x400倍).2所培養(yǎng)細(xì)胞的VII因子相關(guān)抗原免疫組化結(jié)果檢測鏡下可見所培養(yǎng)的細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)核周密集的棕色顆粒(見圖2箭頭所指處)，對照細(xì)胞內(nèi)則未有這種著色現(xiàn)象，據(jù)此鑒定，符合內(nèi)皮細(xì)胞的珊因子相關(guān)抗原免疫組化特征表現(xiàn)。.3不同酶消化HUVEC結(jié)果比較分別用0.125%胰蛋白酶、.025%胰蛋白酶、0.1%膠原酶三種酶消化HUVEC，在不同的消化時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見表l。

共同作用24h后的受試細(xì)胞，以SVtotalRNAisolationsystem試劑盒提取總RNA，后經(jīng)紫外分光光度儀測定，0D26夕OD28。比值為2:1。凝膠電泳結(jié)果可見185和285兩條條帶清晰(見圖3)，說明各組提取的總RNA樣品未降解�？蛇M(jìn)行Rl斗PCR反應(yīng)。285一一一.知185一一一一卜LallC1234圖3不同濃度TG和ul留mLlPs共同作用24h后的受試細(xì)胞總RNA凝膠電泳圖Lanel一4分別為ommolL/，lmmol幾、smmol幾、Iommo比TG組翼4顯示，2一6號(hào)各組處均出現(xiàn)了一條46b4p大小的特異條帶，該條帶與GADPH引物所擴(kuò)增產(chǎn)物的大小一致，即各組細(xì)胞均檢測到了看家基因GADPH的擴(kuò)增條帶，表明本次試驗(yàn)條件穩(wěn)定、可信度高。與Makrer比對，2一6號(hào)各組均檢測到352bp另一特異性條帶
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2530153