發(fā)布時間：2019-08-24 14:11

【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是一個全球性的危害人類健康的重要病原體，感染機體后極易導致慢性肝炎、并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死，最終導致肝癌。目前對于丙型肝炎病毒致病機制的了解仍然非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外，病毒蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要作用。在組成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Structural Protein)和非結(jié)構(gòu)蛋白中(Non-structural Protein)，非結(jié)構(gòu)蛋白5A(NS5A)通過與細胞蛋白的相互作用在信號轉(zhuǎn)導、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運、抗細胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用，并且許多相互作用的后果都能維持或促進病毒在細胞內(nèi)的持續(xù)復制，但其詳細機制有待進一步明確。本文以NS5A蛋白為釣餌，通過篩選人胎肝細胞cDNA基因文庫，尋找與HCV NS5A蛋白相互作用的細胞蛋白，在此基礎(chǔ)上進一步確認NS5A與細胞蛋白的相互作用并研究其生物學意義。 首先構(gòu)建了HCV NS5A酵母表達質(zhì)粒，并利用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)對人胎肝細胞cDNA文庫進行篩選。通過第一輪篩選初步獲得陽性候選克隆后，將上述克隆再次分別與NS5A釣餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母細胞進行第二輪驗證，獲得十二個陽性克隆。測序后通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)這十二個克隆含有兩個cDNA序列，分別編碼38kD免疫抑制劑FK506結(jié)合蛋白(38kD immunosuppmssant FK506-bindingprotein，F(xiàn)KBP38)和ADP核糖基化樣因子6的作用蛋白(ADP-ribosylation-likefactor-6 interacting protein 1，Aip-1)。已有文獻報道，NS5A可以通過不同途徑抑制細胞凋亡，而FKBP38能通過其跨膜端將Bcl-2抗凋亡家族的兩個分子Bcl-2和Bcl-xL錨定到線粒體外膜上從而發(fā)揮抗凋亡作用。由此可以推測NS5A與FKBP38的相互作用有可能參與抑制細胞凋亡，值得作進一步研究。為進一步驗證NS5A與FKBP38的相互作用，首先通過體外翻譯獲得~(35)S標記的NS5A和帶HA標簽的FKBP38。免疫共沉淀結(jié)果顯示在HA抗體存在下，NS5A和HA-FKBP38在體外可發(fā)生物理上的結(jié)合。進一步構(gòu)建NS5A-myc和HA-FKBP38真核表達質(zhì)粒并共轉(zhuǎn)Cos7非洲綠猴腎細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是加入myc抗體還是佸抗體，這兩個蛋白始終在免疫復合物中被檢測到。進一步在HCV亞基因組復制子細胞的裂解液中，加入上述蛋白抗體也獲得同樣結(jié)果。同時，通過免疫共沉淀還發(fā)現(xiàn)FK506并不影響上述兩個蛋白的結(jié)合。然后應用免疫熒光和激光共聚焦掃描確認兩者在細胞內(nèi)的相互作用。結(jié)果顯示無論是瞬時共轉(zhuǎn)還是在HCV亞基因組復制子細胞中，這兩個蛋白均存在于胞漿的相同位點。進一步利用亞細胞器特異性染料和標志蛋白進行激光共聚焦發(fā)現(xiàn)FKBP38定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，而NS5A定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并有部分存在于線粒體。進一步運用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)和激光共聚焦進行突變體分析，，發(fā)現(xiàn)NS5A的148-236位氨基酸參與了和FKBP38的相互作用，且這一片斷包含一個Bcl-2同源區(qū)；而FKBP38的跨膜區(qū)對它與NS5A的結(jié)合也至關(guān)重要。上述結(jié)果證明NS5A和FKBP38之間存在直接的相互作用。 為研究NS5A與FKBP38相互作用對細胞凋亡的影響，建立了表達NS5A的Huh7-NS5A穩(wěn)定細胞株。利用該細胞株和HCV亞基因組復制子細胞，發(fā)現(xiàn)這兩種細胞都能抑制凋亡誘導劑引起的細胞凋亡；當用siRNA干擾技術(shù)抑制HCV亞基因組復制子細胞中的NS5A后，復制子細胞部分恢復凋亡敏感性，提示NS5A具有抗凋亡活性。另一方面，利用siRNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源性FKBP38表達后發(fā)現(xiàn)這兩種細胞部分恢復對凋亡誘導劑的敏感，而對照細胞無明顯差異，提示NS5A的這種抗凋亡活性依賴于FKBP38。在Huh7-NS5A穩(wěn)定細胞株中通過siRNA干擾FKBP38后檢測凋亡誘導劑誘導凋亡后PARP剪切體的量，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞株中被剪切的PARP量明顯較少，說明NS5A的抗凋亡作用可能是通過穩(wěn)定線粒體的方式實現(xiàn)。鑒于Bcl-2在Huh7細胞中缺如，以上結(jié)果提示在Huh7細胞中NS5A可能發(fā)揮類似抗凋亡分子Bcl-2的作用，并且這種作用可能是通過FKBP38實現(xiàn)。 綜上所述，本文應用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)以HCV NS5A為誘餌對人胎肝cDNA文庫進行了篩選，發(fā)現(xiàn)FKBP38是NS5A的相互作用蛋白．在確認NS5A與FKBP38相互作用的基礎(chǔ)上，研究了這種相互作用對細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)了NS5A抑制細胞凋亡可通過FKBP38所介導，提出了NS5A抑制細胞凋亡一種新的途徑，豐富了對NS5A抗凋亡機制的認識，為進一步研究病毒蛋白與細胞蛋白之間的相互作用，闡明HCV的致病機制打下了良好基礎(chǔ)。
【圖文】：

/X一a一Gal(20ug/ml)平板上僅PGBKT7一NSSA與pACTZ一FKBP38的共轉(zhuǎn)化子及陽性對照組可見藍色菌落，其它空載體及陰性對照組均不變藍，也無明顯生長跡象(圖1.3.)。說明NSSA或FKBP38的單獨表達都無法激活酵母報道基因的表達，報道基因的激活依賴于Ns5A與FKBP38的相互作用。SD/一TrP一 LeuSD/一Trp一Leu一His一Ade/3一AT圖1.2.酵母轉(zhuǎn)化生長實驗兩圖中從上至下六組菌落依次為下列共轉(zhuǎn)化子 :(1)pGBKT7+pAcTZ;(2)pGBKT7一NSSA+pACTZ一FKBP38:(3)PGBKT7一 NSSA+PACTZ;(4)pGBKT7+pACTZ一FKBp38;(5)陽性對照:pGBKT7一p53+pGADT7一T;(6)陰性對照:pGBKT7一lam+pGADT7一T

Ns5A與細胞蛋白FKBP38相互作用的確認及胞中NSSA和內(nèi)源性的FKBP38是否在HCV感染的生理情況下同基因組復制子細胞作為研究對象DNA3艦A一FKBP38，轉(zhuǎn)染48小時小鼠正常血清)沉淀免疫復合物，顯示，內(nèi)源性的Ns5A與過表達的HCVRePlicon細胞裂解液作免性的FKBP38同樣存在直接的相下NSSA可以和FKBP38發(fā)生相InPut
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R373

【共引文獻】

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5 ;Cloning and identification of NS5A TP2gene and its spliced variant transactivated by hepatitis C virus non-structural protein 5A[J];World Journal of Gastroenterology;2004年12期

6 Panasiuk Anatol;Prokopowicz Danuta;Dzieciol Janusz;Panasiuk Bozena;;Expression of bcl-2 protein in chronic hepatitis C:Effect of interferon alpha 2b with ribavirin therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2005年19期

7 Jean Dubuisson;;Hepatitis C virus proteins[J];World Journal of Gastroenterology;2007年17期

8 Mohammad Irshad;Dhananjay Singh Mankotia;Khushboo Irshad;;An insight into the diagnosis and pathogenesis of hepatitis C virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

9 于彥麗;李艷嬌;龐凱元;張發(fā)軍;孫琦;李文才;孟昭東;;植物FKBP基因家族的結(jié)構(gòu)及生物學功能[J];遺傳;2014年06期

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本文編號：2529015