【摘要】： 目的:肝臟具有很強的再生能力。大鼠肝切除70%后,殘余肝在數(shù)小時內(nèi)啟動再生過程,并于術(shù)后7天左右的時間完全修復(fù)缺失肝組織。肝再生是一個非常復(fù)雜的過程,目前對再生機制的研究仍不十分清楚。解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)是線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子通道,廣泛分布于嚙齒類動物各組織器官中。UCP2被激活時能引發(fā)質(zhì)子漏,質(zhì)子經(jīng)UCP2滲漏回基質(zhì),使氧化磷酸化部分解耦聯(lián);適時降低線粒體膜電位,減少過量ROS的產(chǎn)生。因此,UCP2對細胞能量代謝及ROS產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用。已知正常肝實質(zhì)細胞不表達UCP2,但肝部分切除或肝毒劑損傷肝臟后導(dǎo)致肝再生時,再生肝實質(zhì)細胞UCP2表達卻顯著增加。UCP2在再生肝內(nèi)高表達有何意義目前還不十分清楚。 本研究通過制備大鼠肝再生模型,動態(tài)監(jiān)測肝再生過程中UCP2的表達;探討UCP2表達與肝細胞增殖、肝細胞功能的相關(guān)性,能進一步認識肝臟生理活動的規(guī)律和肝再生的調(diào)控機制;為臨床肝損傷、部分切除甚至移植等肝損傷與再生的應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)。 方法:本研究選用健康雄性Wistar大鼠,體重180±20g,隨機分為假手術(shù)組(SH)和肝切組(PH),肝切組大鼠根據(jù)術(shù)后的不同時間點又分為24h,48h,72h,96h四組,每組5只。按Higgins和Anderson方法,將禁食12 h后大鼠行70%肝部分切除術(shù),術(shù)后自由攝食飲水。假手術(shù)組大鼠只行開腹手術(shù),不實行肝切。手術(shù)后在上述不同時間點稱量大鼠體重;斷頭取血,血清標(biāo)本4℃保存?zhèn)溆?稱取新鮮肝組織0.5g,用于丙二醛(malondialdehyde,MDA)、轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)檢測;并提取肝線粒體測定膜電位、UCP2表達。另取部分肝組織,經(jīng)10%中性福爾馬林固定,用于形態(tài)和免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果: 1.再生肝的重量及組織形態(tài)學(xué)改變 與假手術(shù)組比較,術(shù)后24h肝重與體重比值顯著降低(P 0.05)。48h、72h比值逐漸升高,至96h比值接近假手術(shù)組比值。HE染色顯示,假手術(shù)組肝細胞核大小正常,罕見核分裂。肝切后24h和48h肝細胞增殖旺盛,核分裂顯著增加,中央靜脈擴張,其周圍細胞松散;肝切96h肝細胞重構(gòu)排列成索狀,偶見核分裂,肝臟處于再生末期。 2.再生肝血清轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白改變 肝切后24h大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶急劇增高,谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)達到假手術(shù)組的3倍左右(P 0.05),而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)達到假手術(shù)組6倍左右(P 0.001),至72h和96h已經(jīng)恢復(fù)到假手術(shù)組水平值。肝切后24h大鼠血清白蛋白含量較假手術(shù)組明顯降低(P 0.05),48h、72h逐漸升高,至96h恢復(fù)到假手術(shù)組水平。 3.再生肝組織內(nèi)MDA含量的改變 肝切后24h時肝組織的MDA含量升高,是假手術(shù)組7倍左右(P 0.05),48、72h下降,96h時MDA含量仍略高于假手術(shù)組。 4.再生肝UCP2的表達變化 假手術(shù)組肝實質(zhì)細胞內(nèi)幾乎不表達UCP2蛋白。在肝切術(shù)后24h表達最多,呈強陽性,48、72h表達下降,至肝切術(shù)后96h僅有少量弱表達。Western blot檢測與免疫組化結(jié)果一致,肝切術(shù)后24h時UCP2蛋白水平明顯高于假手術(shù)組(P 0.001)。肝切48小時比假手術(shù)組高(P 0.05),肝切96小時UCP2表達接近假手術(shù)組。 5.再生肝增殖細胞核抗原的表達變化 PCNA陽性細胞統(tǒng)計顯示,肝切術(shù)后24h肝細胞PCNA強陽性表達,為假手術(shù)組13倍(P 0.05)。隨后下降,肝切術(shù)后48h組為假手術(shù)組的8倍(P 0.05),到肝切術(shù)后96h較少表達。 6.再生肝細胞線粒體膜電位和肝組織內(nèi)ATP含量的變化 各時間點的再生肝線粒體膜電位均高于假手術(shù)組,肝切24h組均值為211.19mv,和其它組比較均有顯著差異(P 0.001);肝切術(shù)后48h膜電位均值為187.1mv,仍高于對照組(P 0.01)。肝切術(shù)后24h,加入GDP后線粒體膜電位明顯下降,均值從211.19mv降到181.70mv(P 0.01)。肝切術(shù)后24h肝組織內(nèi)ATP含量最低,為假手術(shù)組的25%(P 0.001),48、72h逐漸增高,到肝切96h已高于假手術(shù)組(P 0.001)。 7.再生肝UCP2表達與肝細胞增殖、線粒體膜電位相關(guān)性分析 將UCP2表達與肝細胞增殖、線粒體膜電位做相關(guān)性分析可知,UCP2表達和肝細胞增殖、線粒體膜電位之間存在顯著的正相關(guān)(P 0.001,r=0.946;P 0.001,r=0.813);肝細胞增殖和線粒體膜電位之間也存在顯著的正相關(guān)(P 0.001,r=0.843)。 結(jié)論: 1.肝部分切除導(dǎo)致肝功能下降,隨肝的再生逐漸恢復(fù)。 2.大鼠肝再生過程中24h肝細胞UCP2表達最多,隨肝的再生逐漸降低。 3. UCP2表達與細胞增殖、線粒體膜電位之間存在顯著的正相關(guān)。肝細胞增殖和線粒體膜電位之間也存在顯著的正相關(guān)。 4. UCP2可通過質(zhì)子回漏適當(dāng)降低線粒體較高的膜電位,限制ROS堆積。
【圖文】：

圖 1 肝切后不同時間點的再生肝生長變化s of ratio of regenerating liver and body weight at different time point after PH SH group,#P < 0.05 vs. 96h after PH group. n=5.切后再生肝組織形態(tài)學(xué)改變色結(jié)果顯示，假手術(shù)組肝細胞在中央靜脈周圍呈放射狀排列，大小正常，罕見核分裂。肝切后 24h 和 48h 肝細胞處于增殖、胞體積、核變大，核分裂急劇增加；中央靜脈擴張，靜脈周圍胞排列較緊密（圖 2B 和圖 2C 所示）。肝切后 72h 中央靜脈周未排列好，條索狀排列不明顯（圖 2D）。肝切 96h 中央靜脈周構(gòu)排列成索狀，細胞體積、核大小正常，，偶見核分裂（圖 2E）后 24h 處于再生初期，至 96h 處于肝再生末期，殘余肝已再生

圖 2 肝切后不同時間點的再生肝組織形態(tài)學(xué)變化 200×Fig.2.Morphological changes of the regenerating liver after PH in rats. 200×肝切后不同時間點血清白蛋白水平變化圖 3 肝切后不同時間點血清白蛋白含量的改變 (n=5)ig.3. Changes of serum albumin contents in the regenerating liver after PH in r
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R33

【共引文獻】

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本文編號：2526206