【摘要】： 【目的】探索體外定向誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞橫向分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性,并檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具備分泌胰島素和胰高血糖素的功能。 【方法】利用長(zhǎng)骨打斷法從健康成年大鼠長(zhǎng)骨中沖洗出骨髓細(xì)胞,用含20%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代細(xì)胞以利于細(xì)胞生長(zhǎng),通過換液將懸浮生長(zhǎng)的造血干細(xì)胞及其它不貼壁的雜細(xì)胞去除,原代細(xì)胞長(zhǎng)滿匯合80%所需時(shí)間為7-9天,然后細(xì)胞通過傳代進(jìn)行純化和擴(kuò)增。采用兩期誘導(dǎo)方案對(duì)第三代(P3)或以后細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),第一期:用誘導(dǎo)液1(含20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 10ng/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及2%B27的DMDM/F12培養(yǎng)液)誘導(dǎo)BMSCs向巢蛋白(nestin)陽性的祖細(xì)胞分化;第二期:用誘導(dǎo)液2(含10 ng/mLβ細(xì)胞調(diào)節(jié)素, 10 ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 10 ng/mL活化素A和10 mmoL/ L尼克酰胺及2 % B27的HG-DMEM培養(yǎng)液)將nestin陽性的祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化。用雙硫腙(DTZ)染色鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)是否含有胰島素;免疫熒光法、免疫組織化學(xué)法(卵白鏈霉素-過氧化氫-DAB)檢測(cè)誘導(dǎo)前后nestin,、胰島素、胰高血糖素蛋白的表達(dá);用含5.6 mmol/ L葡萄糖(L)、16.7mmol/ L葡萄糖(H)的PBS緩沖液1 mL先后不同次序分別孵育1/2 h、1h,收集上清,采用放射免疫分析法檢測(cè)各上清中的胰島素含量。 【結(jié)果】通過傳代純化后的BMSCs(P6)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志CD45(-)、CD29(+)及CD90(+),并且檢測(cè)傳代后的細(xì)胞純度可達(dá)99.88%。BMSCs經(jīng)第一期誘導(dǎo)3d即可檢測(cè)出nestin蛋白的表達(dá),兩期誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)用雙硫腙染色呈陽性。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示經(jīng)兩期誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)表達(dá)胰島素、胰高血糖素等激素。放免分析結(jié)果顯示二期誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)可以分泌少量的胰島素,糖反應(yīng)性較弱。 【結(jié)論】健康成年大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)具有很強(qiáng)的增殖能力,并且具有一定的可塑性。傳代純化后的BMSCs通過添加不同生長(zhǎng)因子組合經(jīng)體外誘導(dǎo)可分化為分泌胰島素的細(xì)胞團(tuán),且該誘導(dǎo)方案具有可重復(fù)性。理論上將有可能解決糖尿病自體胰島細(xì)胞移植介入療法所面臨的供者細(xì)胞嚴(yán)重不足、移植排斥反應(yīng)等問題,為介入放射學(xué)技術(shù)靶向性輸注胰島素分泌細(xì)胞提供前期理論基礎(chǔ),從而為“個(gè)體化胰島細(xì)胞”的構(gòu)建提供一種
【圖文】：

1 大鼠 BMSCs5d（P0,100×），可見細(xì)胞呈集落性生長(zhǎng)2 大鼠 BMSCs20d（P3,200×）3 大鼠 BMSCs 堿性磷酸酶染色部分呈陽性（P0,400×），胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒。（箭4 大鼠 BMSCs 堿性磷酸酶染色陰性（P5,400×）

1 大鼠 BMSCs5d（P0,100×），，可見細(xì)胞呈集落性生長(zhǎng)2 大鼠 BMSCs20d（P3,200×）3 大鼠 BMSCs 堿性磷酸酶染色部分呈陽性（P0,400×），胞漿內(nèi)含有棕黃色顆粒。（箭4 大鼠 BMSCs 堿性磷酸酶染色陰性（P5,400×）
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R329.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 何俊丹;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2525138