【摘要】： 目的:鉤端螺旋體病是一種由致病性鉤端螺旋體引起的世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患性傳染病。目前所用的商品化疫苗只能產(chǎn)生短期免疫效果,且缺乏不同血清型間的交叉保護作用。鉤端螺旋體外膜蛋白在疾病感染中發(fā)揮重要作用,并具有屬特異性,成為目前鉤體疫苗開發(fā)的熱點。本實驗運用逆向疫苗學(xué)的理論和方法對鉤體部分疫苗候選基因進行分析及免疫學(xué)特征檢測,旨在篩選出高效、廣譜的鉤體疫苗候選基因。 方法:本實驗首先從已預(yù)測出的鉤體疫苗候選基因挑取8個基因,進行生物學(xué)特征分析。并對這8個基因進行克隆、表達、純化并制備多克隆抗體。通過ELISA及Western blot方法檢測鉤體疫苗候選基因編碼蛋白與感染鉤體動物血清的反應(yīng)性;流式細胞術(shù)檢測其在鉤體細胞中的定位;以及Western blot檢測外膜蛋白在我國15株致病性問號鉤體及1株非致病鉤體中的表達情況。從而篩選出更高效、廣譜的鉤體疫苗候選者。此外,從篩選出的蛋白中選取LA3469編碼的鐵離子調(diào)節(jié)蛋白A,經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測其生物特征,并通過體外黏附抑制實驗及殺菌實驗檢測該蛋白所產(chǎn)生抗體的免疫保護性,進而通過改變環(huán)境中鐵離子濃度及檢測鉤體感染動物體內(nèi)鐵離子濃度的變化,研究鉤體的生長及致病性與鐵離子調(diào)節(jié)的關(guān)系。 結(jié)果:通過對這8個鉤體疫苗候選基因的信號肽,跨膜結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析,推測這8個蛋白可能均位于外膜,均含有較多的T、B細胞抗原表位,因此可能會刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)。成功構(gòu)建這8個鉤體疫苗候選基因的原核表達重組體,并成功表達,純化其中7個并制備多克隆抗體,這7個基因分別為LA0272、LA0301、LA0365、LA1404、LA1495、LA3469及LB061。進而對這7個基因所編碼蛋白的免疫學(xué)特征進行檢測。實驗表明這7個鉤體外膜蛋白均具有較強的免疫原性及與鉤端螺旋體賴株兔血清的免疫反應(yīng)性;流式細胞術(shù)檢測未知蛋白的細胞定位,分析篩選出4個位于外膜的蛋白基因:LA0301、LA1495、LA3469和LB061。保守性分析顯示:LA0301、LA3469和LB061編碼蛋白在鉤體賴型致病株及非致株中均表達,而LA1495和LA1404在致病株中表達,而非致病株中不表達。綜合以上結(jié)果篩選出4個新的未知功能基因(LA0301、LA1495、LA3469和LB061)作為鉤體疫苗候選基因。 此外,LA3469是由COG注釋的鐵離子調(diào)節(jié)蛋白A基因,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測在LA3468～LA3471區(qū)可能存在一個鐵離子調(diào)節(jié)域。并實驗證明鉤體在體外生長及體內(nèi)感染過程中均與鐵離子調(diào)節(jié)有關(guān),因此LA3469編碼的蛋白可能是與鉤體致病性相關(guān)的蛋白。鉤體黏附抑制實驗及殺菌實驗表明LA3469編碼蛋白的抗體在體外具有良好的免疫保護性。因此,LA3469可能是良好的疫苗候選基因。 結(jié)論: (1)本實驗運用逆向疫苗學(xué)的方法篩選到4個新的未知功能基因(LA0301、LA1495、LA3469和LB061)作為鉤體疫苗候選基因。為進一步大規(guī)模篩選和鑒定疫苗候選基因構(gòu)建了實驗平臺。 (2)本實驗首次通過流式細胞術(shù)鑒定鉤體外膜蛋白的細胞定位,為大規(guī)模篩選鑒定鉤體新的外膜蛋白質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 (3)通過對鉤體疫苗候選基因LA3469進一步研究,表明鉤體的生長與致病性可能與鐵離子調(diào)節(jié)有關(guān),LA3469編碼的鐵離子調(diào)節(jié)蛋白A可能是與鉤體致病性相關(guān)的蛋白,其抗體具有體外免疫保護性。因此,LA3469可能是有效的鉤體疫苗候選基因。
【圖文】：

22圖1-2-2 重組質(zhì)粒pQE31-OMP的構(gòu)建圖Fig.1.2.2 The construction of recombinant plasmid pQE31-OMP.Purified PCR products ofOMPs gene for sequenceing were cloned into PMZ and then subcloned into pQE31.

25圖 1-2-3 OMPs 基因的 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1-2-3 PCR of objective geneDNA Maker; a: LA0272; b: LA0310; c: LA0410; d: LA0365; e: LA1404; f: LA14g: LA3469; h: LB061組質(zhì)粒的酶切鑒定組質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析得到 2 個 D
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

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本文編號：2524945