【摘要】： 納米技術(shù)在藥物載體領(lǐng)域的運用催生了一大批納米藥物載體。由于納米粒子具有的獨特性質(zhì),納米藥物載體表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能�，F(xiàn)在,已經(jīng)有多種納米藥物載體參與疫苗的設(shè)計與制備并取得良好效果。 納米疫苗起效的首要因素是抗原提呈細(xì)胞(APC)對納米藥物的攝取和遞呈。雖然納米疫苗的有效成分為抗原蛋白、多肽或編碼抗原的基因,但納米藥物載體本身亦被APC攝取,此過程中可能會對APC的活性與功能產(chǎn)生一定影響。納米乳劑與納米脂質(zhì)體作為納米藥物載體都有著廣泛的應(yīng)用前景,我實驗室已在前期研究中制備了納米乳劑及納米脂質(zhì)體包裹腫瘤特異性抗原的腫瘤納米疫苗,并在動物實驗中取得了良好的效果。但在進一步的研究中,我們發(fā)現(xiàn)納米乳劑在動物體內(nèi)可能有一定毒性,當(dāng)達到一定用藥量后與對照組相比,乳劑組的小鼠死亡率明顯增高。DC作為抗原遞呈能力最強、唯一可誘導(dǎo)靜止T細(xì)胞活化的APC越來越受到人們重視。以DC為靶向的納米疫苗藥物載體已成為納米醫(yī)藥領(lǐng)域研究的新方向,特別是在腫瘤免疫中,利用納米藥物載體將腫瘤特異性抗原靶向輸送給DC,通過DC的加工將抗原肽遞呈到表面MHC-Ⅰ類分子上,激活下游的CD8+T細(xì)胞,產(chǎn)生針對腫瘤特異性抗原的CTL克隆,最終發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。目前還沒有文獻報道納米藥物載體對人DC的毒性作用和活性影響。本研究首先建立了人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)來源DC和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動員人外周血干細(xì)胞(PBSC)來源DC的培養(yǎng)方法。在此基礎(chǔ)上,以形態(tài)學(xué)為主要研究手段,研究了納米乳劑及納米脂質(zhì)體在體外對人PBMC來源樹突狀細(xì)胞的影響。本研究主要內(nèi)容有: 1.人PBMC及PBSC來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng) 目的:改進人PBMC分離培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞的方法,以獲得數(shù)量與純度更高的樹突狀細(xì)胞。建立經(jīng)G-CSF動員PBSC來源DC的培養(yǎng)方法。方法:利用連續(xù)貼壁法分離獲得人外周血來源CD14+前體細(xì)胞,經(jīng)粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟DC。骨髓移植健康供者在G-CSF動員4d后,Cobe SpectraTM血細(xì)胞分離機分離獲得PBSC,以其為前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生DC。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測兩種來源DC表面標(biāo)志物表達水平,透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察PBMC來源DC的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:連續(xù)貼壁法體外分離培養(yǎng)人PBMC來源DC,所獲得DC數(shù)量和純度均高于以往一次貼壁分離培養(yǎng)的DC。在GM-CSF、IL-4以及TNF-α的聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后,DC高表達CD1a(44.16%)、CD40(75.04%)、HLA-DR(95.98%)、CD83(57.25)、CD86(73.20%)。SEM觀察到DC典型形態(tài):細(xì)胞直徑多在10μm以上,表面微絨毛豐富,從胞體輻射狀伸出數(shù)個粗細(xì)不等的突起。TEM觀察可見:DC胞漿內(nèi)溶酶體豐富,Golgi復(fù)合體發(fā)達,還可見到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)及其周圍分布的豐富的線粒體(Mit)。細(xì)胞核不規(guī)則,常偏于一側(cè)。培養(yǎng)第15dDC還觀察到明顯的凋亡與吞噬現(xiàn)象。經(jīng)G-CSF動員PBSC誘導(dǎo)培養(yǎng)所獲得DC的數(shù)量更多,5ml富集PBSC的分離液可培養(yǎng)超過107個DC,PBSC來源DC誘導(dǎo)培養(yǎng)所需時間較PBMC來源DC長2-3d,培養(yǎng)過程中消耗更多細(xì)胞因子,所獲得DC高表達CD1a(48.73%)、CD40(85.04%)、HLA-DR(91.12 %)、CD83(55.11%)和CD86(80.10%),其表型與形態(tài)與PBMC來源DC無明顯差異。結(jié)論:在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上,建立了連續(xù)貼壁法分離培養(yǎng)PBMC來源的DC。與傳統(tǒng)方法相比,改進后的方法可分離培養(yǎng)數(shù)量較大、純度較高的人PBMC來源DC。同時建立了G-CSF動員及細(xì)胞分離機分離PBSC誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生DC的方法,此方法雖然培養(yǎng)周期較長且費用高,但獲得DC數(shù)量非常多,血液其他成分浪費少,應(yīng)用前景廣闊。 2.納米乳劑/納米脂質(zhì)體對DC的影響 目的:了解納米乳劑/納米脂質(zhì)體對人DC的影響。方法:人PBMC來源DC培養(yǎng)5d后,將不成熟DC分別負(fù)載不同濃度納米乳劑/納米脂質(zhì)體,孵育48h,光鏡觀察DC形態(tài)變化,FCM檢測DC表面分子表達,TEM觀察DC攝取納米藥物載體后形態(tài)與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。MTT檢測負(fù)載納米微粒的DC對自體T淋巴細(xì)胞的促增殖能力。結(jié)果:①納米乳劑組:在1×10~5 /1ml DC中加入100μl納米乳劑后,光鏡觀察發(fā)現(xiàn)DC發(fā)生嚴(yán)重水腫,最終崩解壞死。在1×105 /ml DC中加入納米乳劑20-50μl,光鏡下觀察DC腫脹,TEM顯示大部分DC發(fā)生細(xì)胞水腫,胞內(nèi)各種細(xì)胞器均發(fā)生擴張,胞核變大,水腫細(xì)胞內(nèi)有脂滴樣物質(zhì),部分細(xì)胞胞膜斷裂甚至壞死崩解。在1×10~5 /ml DC中加入10μl乳劑,光鏡下細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,TEM僅見細(xì)胞攝取納米乳劑后形成的吞噬溶酶體。FCM檢測顯示負(fù)載10μl納米乳劑后,DC表面CD83表達量上調(diào)。MTT結(jié)果顯示,當(dāng)納米乳劑劑量達到20μl后,DC促進T細(xì)胞增殖的能力明顯下降。②納米脂質(zhì)體組:在1×10~5 /ml DC中加入50或100μl的納米脂質(zhì)體后,光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變圓,表面樹枝樣突起減少,TEM顯示DC內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積,部分細(xì)胞內(nèi)有膽固醇結(jié)晶,但未見細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡。FCM檢測顯示:DC表面分子CD83表達量未見變化,其促進T細(xì)胞增殖的能力也無明顯變化。結(jié)論:適宜劑量的納米乳劑可作為一種藥物載體被DC細(xì)胞有效吞噬攝取,并作為一種外來抗原促進DC的成熟分化。但當(dāng)1×10~5 /ml DC中加入的乳劑劑量超過20μl時,DC出現(xiàn)水樣變性甚至壞死,毒性明顯。DC對納米脂質(zhì)體的相容性明顯強于納米乳劑,在劑量達到100μl后DC仍具有良好的形態(tài)與活性。 本研究在體外條件下模擬和評價了納米脂質(zhì)體對抗原加工、處理和遞呈具有關(guān)鍵作用的DC的毒性和活性的影響,結(jié)果以納米脂質(zhì)體作為抗原載體對DC是無毒性的,活性亦無影響,此為納米脂質(zhì)體腫瘤疫苗的研發(fā)提供了重要的實驗基依據(jù)。
【圖文】：

且具有典型DC形態(tài)的細(xì)胞在總的培養(yǎng)細(xì)胞中比例大于80%。光鏡觀察顯示，最初培養(yǎng)的1-4h，細(xì)胞疏松地貼附于瓶壁上，細(xì)胞體積中等，形態(tài)較圓（圖2.1）。隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸呈懸浮生長，細(xì)胞形狀由近似圓形逐漸變得不規(guī)則，表面伸出粗細(xì)不等的凸起，類似粗樹枝分叉狀或細(xì)絲狀。培養(yǎng)至第5d，表面突起逐漸增多，分布不規(guī)則，有的在細(xì)胞表面分布較均勻，可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象（圖2.2），貼壁細(xì)胞少見。至第7d細(xì)胞體積較之前明顯增大，直徑在10-20μm左右，細(xì)胞由聚集狀態(tài)逐漸分散懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞表面突起粗大

表面伸出粗細(xì)不等的凸起，類似粗樹枝分叉狀或細(xì)絲狀。培養(yǎng)至第5d，表面突起逐漸增多，分布不規(guī)則，有的在細(xì)胞表面分布較均勻，可見細(xì)胞聚集現(xiàn)象（圖2.2），貼壁細(xì)胞少見。至第7d細(xì)胞體積較之前明顯增大，直徑在10-20μm左右，細(xì)胞由聚集狀態(tài)逐漸分散懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞表面突起粗大，分支明顯，，似樹枝狀，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、星形及不規(guī)則形狀（圖2.3）。- 38 -A. 細(xì)胞貼壁形態(tài)（×400）B. 12h后 細(xì)胞形態(tài)（×200）圖2.1 培養(yǎng)12h內(nèi)DC的光鏡下形態(tài)，細(xì)胞基本呈圓形。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R94

【參考文獻】

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1 葉海英,張忠義,高申,魯瑩,汪艷;法莫替丁微乳的研制及其質(zhì)量評價[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年01期

本文編號：2525270