【摘要】：第一部分 CLN8P相互作用蛋白質(zhì)的篩選 目的 CLN8是神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)這一疾病群中的一個(gè)致病基因。關(guān)于其功能知之甚少。我們采用酵母雙雜交技術(shù)。篩選人胎腦cDNA文庫(kù)表達(dá)產(chǎn)物中與CLN8P相互作用的分子,初步探討CLN8P的功能,為其在發(fā)病機(jī)制中的作用提供新線索。 方法 將CLN8構(gòu)建到酵母雙雜交系統(tǒng)中的pLexA載體,檢測(cè)該重組質(zhì)粒對(duì)報(bào)告基因LacZ的自激活作用。通過酵母雙雜交方法,從人胎腦cDNA文庫(kù)表達(dá)產(chǎn)物中篩選與CLN8P相互作用的分子,提取陽性克隆質(zhì)粒DNA,進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析。 結(jié)果 成功構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)plexA-CLN8誘餌質(zhì)粒,誘餌質(zhì)粒對(duì)報(bào)告基因LacZ無自激活作用,篩選到41個(gè)陽性克隆。序列測(cè)定表明,其中有一個(gè)陽性克隆編碼人NADH脫氫酶亞單位5。 結(jié)論 1、CLN8P與ND5在酵母細(xì)胞中有相互作用。 2、ND5與CLN8P結(jié)合,可能是造成脂褐質(zhì)線粒體ATP合酶亞基C積聚的新機(jī)制之一。 第二部分 CLN8基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及檢測(cè) 目的 構(gòu)建真核表達(dá)載體,為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證CLN8與ND5是否存在相互作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增CLN8基因,將其亞克隆到P-Flag真核表達(dá)載體,在HeLa細(xì)胞中表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。 結(jié)果 特異擴(kuò)增CLN8基因編碼序列,構(gòu)建了真核表達(dá)載體P-Flag-CLN8,在HeLa
【圖文】：

和分析建酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質(zhì)粒p1xeA一1ns1PCR擴(kuò)增c1ns基因片段行設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出帶有所設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的clns基因片段。l%瓊果顯示與預(yù)期值86lPb相符(圖)l。重組質(zhì)粒plxeA--C!n8的酶切鑒定組質(zhì)粒pelAx‘In8用EocRI和眾01雙酶切后，得到兩個(gè)D為10.2kb和gooPb，，小片段大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致，大片段大小片段一致，這些均與預(yù)期值相符(圖2)。M12

分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化有陽性質(zhì)粒的酵母克對(duì)照質(zhì)粒pelAx一os激活下游報(bào)告基因LX一gal，因而菌落變藍(lán)。而陰性對(duì)照以及構(gòu)建色(圖4)，表明構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒對(duì)報(bào)告基
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐東剛;酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2001年06期

2 袁云,陳清棠;神經(jīng)蠟樣質(zhì)脂褐素沉積病[J];中華兒科雜志;2002年10期

本文編號(hào)：2521763