【摘要】：背景 血脂異常與冠心病(coronary heart disease，CHD)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。載脂蛋白是行使脂類轉(zhuǎn)運功能的血漿蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和含量異常將影響血脂代謝。血脂異常是冠心病、動脈粥樣硬化發(fā)生的主要危險因素，也是高血壓、肥胖和胰島素抵抗的易感因素。 載脂蛋白A5(apolipoproteinA5，ApoA5)是2001年P(guān)ennacchio等通過比較人、小鼠基因序列在人11q23染色體ApoA1／C3／A4簇附近發(fā)現(xiàn)的一種新的載脂蛋白。動物模型和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)的研究均表明ApoA5與血清甘油三酯(triglyceride，TG)水平呈負(fù)相關(guān)。此外，ApoA5還可以影響血高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)代謝。除了與血脂的代謝有關(guān)外，目前的研究顯示ApoA5還參與炎癥調(diào)節(jié)，這些都提示ApoA5可能是CHD的危險預(yù)測因子。目前，血清ApoA5濃度尚不清楚，ApoA5SNP是通過影響血清ApoA5濃度還是改變ApoA5的功能來調(diào)節(jié)血TG的代謝也不清楚，血清ApoA5濃度與脂質(zhì)的關(guān)系及是否與CHD相關(guān)知之甚少。由于血清ApoA5的濃度極低，不能直接從血清中提取天然蛋白制備抗體。因此，本研究擬通過基因工程的方法表達(dá)重組ApoA5蛋白，制備抗體，進而檢測血清ApoA5濃度具有重要的臨床意義。 目的 本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)重組ApoA5蛋白，并制備抗ApoA5抗體，檢測血清ApoA5的濃度和ApoA5蛋白在人不同組織的分布，觀察ApoA5與血脂和CHD的關(guān)系。 方法 在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pQE30-ApoA5，表達(dá)重組ApoA5蛋白，，通過鎳-硝基三乙酸(Ni-NTA)親和層析柱在變性條件下純化重組ApoA5蛋白，尿素梯度法透析復(fù)性。以該純化蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔和Balb／c小鼠，分別獲得抗ApoA5的多克隆抗體(polyclonal antibody，多抗)和單克隆抗體(monoclonal
【圖文】：

Q工AquiCkPCR純化試劑盒進行純化(同上)，然后將上述純化的PRC產(chǎn)物和酶切的表達(dá)載體pQE30用T4DNA連接酶進行酶連，構(gòu)建含HIS一ApAoS融合基因的重組質(zhì)粒pQE30一ApoAS(圖1一2)。

CPR產(chǎn)物用%1瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察到編碼全長蛋白、N端蛋白、C端蛋白的擴增產(chǎn)物分別在1041Pb、366Pb、561bp處可見目的條帶，與預(yù)期分子量大小一致(圖1一3)。圖1一3Ap0AS基因CPR產(chǎn)物在106瓊脂糖凝膠上電泳注:1一3分別為編碼APAoS全長蛋白、N端蛋白和C端蛋白的NDA序列的擴增產(chǎn)物，4為陰性對照。3.2原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 畢楠,鄢盛愷,李國平,尹志農(nóng),薛紅,吳剛,陳保生;冠心病患者載脂蛋白A5和載脂蛋白C3基因多態(tài)性的研究[J];中華心血管病雜志;2005年02期

本文編號：2522497