【摘要】： 家豬由于資源豐富、成本低廉和在倫理學、種間傳播疾病等方面的明顯優(yōu)勢已經(jīng)廣泛應用于生物醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域。將豬作為器官供源的豬到人異種移植是緩解目前供器官嚴重短缺的有效途徑，臨床器官供求關(guān)系的持續(xù)緊張和近10年來異種移植研究的快速發(fā)展都迫切需要對家豬的基因組、蛋白質(zhì)組等遺傳學問題進行更深入廣泛的研究來推動異種移植發(fā)展和開拓家豬的醫(yī)學應用前景。 αGT基因敲除豬和人補體調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)基因豬的培育成功有效解決了異種移植中首先面臨的超急性排斥反應，在急性血管性排斥階段，以微血管血栓為主要表現(xiàn)的凝血紊亂成為又一個導致供器官失功，阻礙異種移植發(fā)展的難題。在引起異種移植中凝血紊亂的主要原因中，除了免疫排斥引起的內(nèi)皮細胞損傷、激活外，另一個重要原因就是豬內(nèi)皮細胞表面的抗凝分子和人血循環(huán)中的凝血因子之間功能不匹配，使抗凝減弱而促凝增強。此外，豬到人肝臟移植后，豬肝臟合成異種凝血、抗凝、纖溶因子能否替代人源蛋白在人體內(nèi)發(fā)揮正常的生理功能，能否與人內(nèi)皮細胞和外周血中的凝血調(diào)節(jié)分子相互作用保證機體正常的血流和止血都是異種移植真正走向臨床需要解答的問題。對家豬凝血系統(tǒng)的遺傳特征和生理功能研究是探索異種移植中凝血紊亂機制和功能匹配問題的前提，也為尋找可能的基因改造途徑奠定基礎(chǔ)。 版納微型豬近交系(Banna Minipig Inbred line，BMI)是云南農(nóng)業(yè)大學曾養(yǎng)志教授經(jīng)過20多年連續(xù)同胞交配或半同胞交配培育成功的世界唯一的高度近交小型豬種，在生物醫(yī)學和異種移植研究中都有重要的應用價值。本研究以BMI為研究對象，成功構(gòu)建了肝臟組織cDNA表達文庫。文庫鑒定結(jié)果顯示初級文庫的滴度為0.70×10~6pfu，重組率為96.6％，庫容量為1.05×10~6pfu；擴增文庫的滴度為4.87×10~9，重組率為97.5％。文庫隨機克隆的插入片段長度平均在1200bp。該文庫在復雜度、完整性等方面都達到了后續(xù)基因研究的要求。 為了解BMI肝臟基因表達譜的特征，我們挑選了200個cDNA文庫隨機克隆進行單向測序，獲得192條有效EST序列。BLAST程序比對結(jié)果顯示，其中89個克隆的插入序列與數(shù)據(jù)庫中已有的豬基因匹配，包括一些重要的肝臟功能基因，如白蛋白、細胞色素、載脂蛋白等；70個克隆的插入序列與已知豬基因無匹配，但和其他哺乳動物序列有高度同源性，可能為未知的家豬相應基因序列；另33個序列與核酸數(shù)據(jù)庫中基因無匹配，為新發(fā)現(xiàn)的家豬EST序列。將得到的EST序列及翻譯后的蛋白質(zhì)序列與人相應序列進行同源比對顯示了較高的同源性，但少數(shù)基因如carbamoyl-phosphate synthetasel基因、cytochrome c oxidase subunit 1、3、基因和catalase基因沒有發(fā)現(xiàn)人的同源基因，推測可能是豬進化中特有基因。從序列比對中還發(fā)現(xiàn)，在這些EST序列中，22個含有完整的讀碼框，38個有完整的5’末端序列，140個有完整的3’末端序列。 凝血因子(coagulation factor，CF)Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ，抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)和纖溶酶原(plasminogen，PLG)是凝血、抗凝和纖溶系統(tǒng)中的重要因子，目前豬的這些基因序列都還未見報道。我們通過噬菌斑雜交方法和PCR方法篩選BMI肝臟cDNA文庫得到插入有目的基因的陽性克隆，再結(jié)合5'RACE末端擴增技術(shù)，得到BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ的全長cDNA；通過電子克隆方法得到BMI PLG的全長cDNA。測序結(jié)果顯示，克隆得到BMI CFⅡ全長cDNA 2027bp，CFⅦ1416bp，CFⅩ1856bp，，AT-Ⅲ1498bp，PLG 2768bp。以上序列均提交GenBank，獲得基因登記號分別為：DQ530370、DQ530371、DQ530372、DQ530373、DQ5303704。 在得到克隆的新基因序列后，我們利用生物信息學方法對BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG核酸及蛋白質(zhì)序列進行了初步分析，通過與人相應序列的同源性比對和蛋白質(zhì)模擬三維結(jié)構(gòu)的比較，初步分析了豬與人凝血因子的相似性和可能存在的差異。結(jié)果顯示：和人相應基因比較，BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG的核酸序列同源性分別為83.84％、78.34％、79.81％、87.67％、80.21％；蛋白質(zhì)序列同源性分別為83％、74.08％、73.10％、89.06％、80.67％；序列比對提示所有的半胱胺酸位點在不同物種間都高度保守；主要催化活性位點在序列和空間位置上也都高度保守；豬和人相應蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中，蛋白骨架的空間構(gòu)相都非常相似。提示這些凝血因子在豬和人之間可能具有相似的生理功能和催化活性，但是在一些特殊位點的序列差異可能造成空間構(gòu)相和空間位阻的變化，在和底物結(jié)合以及其他大分子結(jié)合的能力上產(chǎn)生差異。 此外，我們還初步探索了BMI CFⅡ基因的體外蛋白表達方法。分別構(gòu)建了重組CFⅡ的原核表達載體PET22b-cfⅡ、畢赤酵母表達載體pPIC-9K-cfⅡ和真核細胞表達載體pcDNA3.1~+-cfⅡ。在原核表達中目標蛋白主要以包涵體形式誘導表達。在畢赤酵母表達過程中，在篩選得到的His+和Geneticin+重組克隆誘導培養(yǎng)上清中檢測到了目標蛋白的存在，但結(jié)果提示表達量很小，培養(yǎng)上清用二期法未檢測到cfⅡ活性。真核細胞表達過程中，經(jīng)G418抗性篩選得到了含有pcDNA3.1~+-cfⅡ的重組CHO細胞株。但在重組細胞的培養(yǎng)上清中未檢測到目的蛋白的表達。CFⅡ是一種分子量較大的真核蛋白，空間結(jié)構(gòu)復雜，需要經(jīng)過復雜的翻譯后修飾過程，所以體外表達難度較大。建立有效的凝血因子體外表達系統(tǒng)還需更多的實驗摸索。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了版納微型豬近交系(BMI)肝臟cDNA表達文庫；并初步研究BMI肝臟基因表達譜特征，鑒定得到了多個家豬新基因EST序列；克隆得到了重要的凝血相關(guān)因子CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ和PLG的全長cDNA序列；通過生物信息學分析初步比較了BMI凝血因子與人的差異；并對體外表達凝血因子方法進行了初步探索，為今后對家豬凝血相關(guān)因子進行功能學研究，探索異種移植中凝血紊亂的分子機制和肝臟功能匹配問題奠定了基礎(chǔ)，也為尋找家豬凝血系統(tǒng)的基因改造靶點，提供了分子遺傳基礎(chǔ)。
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四川大學博士學位論文圖1一l:BMI肝臟總RNA瓊脂糖電泳。左為 RL6000RNAmarker，右為BMI總RNA，255亮度是255的兩倍以上。F三9.1一 1:AgarosegelelectrOPhoresisoftatolRNAofBMI Iiverdssue.Therightlane151林 9totalRNA， andthebandsof285， and185areindieated.Theleftlane15RNAmarkerRL6000.﨑一

本文編號：2521673