【摘要】： 隨著現(xiàn)代交通以及建筑的發(fā)展，脊髓損傷(spinal cord injury SCI)患者的數(shù)量與日俱增。外傷性的脊髓損傷危害嚴(yán)重，常導(dǎo)致截癱。包括外科手術(shù)、藥物治療等在內(nèi)，，很多方法正在用于治療脊髓損傷，恢復(fù)患肢功能。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植是一種新的治療方法，植入的細(xì)胞可以替代受損區(qū)域的細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)元回路的重建，恢復(fù)脊髓功能。本研究是通過分子生物學(xué)技術(shù)，在體外構(gòu)建整合有BDNF基因的腺病毒載體，感染體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)元分化。為以后干細(xì)胞體內(nèi)移植治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分脊髓源性性神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與分化 目的探討大鼠脊髓源性胚胎神經(jīng)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)增殖及分化，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。 方法取孕14～16d的SD大鼠胚胎脊髓在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖傳代分化，用神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗體—巢蛋白(Nestin)鑒定克隆細(xì)胞，用特異性的單克隆抗體鑒定克隆球誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞。用Brdu免疫熒光對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞傳代能力檢測(cè)。 結(jié)果獲得了大量能自我增殖并分化的細(xì)胞，分化后主要產(chǎn)生神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白(MAP-2)染色陽性的神經(jīng)元質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星行膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞。Brdu免疫熒光顯示神經(jīng)球中絕大多數(shù)細(xì)胞為Brdu陽性細(xì)胞，其細(xì)胞核中可見熒光標(biāo)記物。 結(jié)論該種方法培養(yǎng)的細(xì)胞：①具備生長因子反應(yīng)性，即只有在堿性成纖維生長因子的存在下方可表現(xiàn)出增殖能力并形成所謂的“神經(jīng)球”樣懸浮小體；②可在體外傳代并維持增殖活性；③神經(jīng)球內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞為nestin陽性；④來自一個(gè)神經(jīng)球的細(xì)胞可分化產(chǎn)生3種主要的神經(jīng)細(xì)胞，即培養(yǎng)細(xì)胞具有多向分化的潛能。因而本研究培養(yǎng)的細(xì)胞具備了神經(jīng)干細(xì)胞的基本特性，為接下來的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 第二部分腺病毒載體Ad-BDNF-EGFP的構(gòu)建和在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá) 目的腺病毒載體Ad-BDNF-EGFP的構(gòu)建和在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)情況的檢測(cè)。 方法通過RT-PCR成功從在大鼠的海馬中獲得BDNF基因，通過基因克隆以及HEK293包裝，獲得了含增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組腺病毒表達(dá)載體pAd-BDNF-EGFP，將其感染原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，觀察EGFP及BDNF兩種基因的表達(dá)，鏡下測(cè)定轉(zhuǎn)染率，并對(duì)RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)證實(shí)BDNF的存在。轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)G418篩選，抗性細(xì)胞傳代擴(kuò)增后獲得成功轉(zhuǎn)染BDNF基因的NSCs克隆。 結(jié)果熒光顯微鏡下可見感染后的NSCs表達(dá)EGFP而發(fā)出綠色熒光；通過RT-PCR證明感染后的NSCs具有表達(dá)BDNF的能力；用ELISA鑒定細(xì)胞上清中分泌的BDNF 72h的含量達(dá)到最高，為11.68ng／ml；證明通過構(gòu)建病毒的感染可以使神經(jīng)干細(xì)胞獲得分泌BDNF的能力，并且EGFP基因可作為神經(jīng)干細(xì)胞移植研究中良好的示蹤劑。 結(jié)論腺病毒病毒介導(dǎo)EGFP基因以及BDNF基因在大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞中成功表達(dá)，為我們應(yīng)用分子生物學(xué)、基因技術(shù)，以神經(jīng)干細(xì)胞直接作為基因靶細(xì)胞，介導(dǎo)基因治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病莫定了一定基礎(chǔ)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：NSCs72h后球形懸浮生長100X)
文內(nèi)圖片：
圖片說明：NSCs7211后Nestln染色(200x)
【學(xué)位授予單位】：同濟(jì)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R651.2;R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 王

本文編號(hào)：2515748