【摘要】： 目的:鑒定組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲得的細(xì)胞為未分化的人胚胎生殖細(xì)胞(人EG細(xì)胞);嘗試不同時(shí)間和不同方法對(duì)人EG細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),探討最佳傳代時(shí)機(jī)和傳代方法;并確定傳代培養(yǎng)的細(xì)胞仍為未分化的人EG細(xì)胞。 方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜,用源于自身胚胎組織的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,在不添加任何細(xì)胞因子條件下進(jìn)行組織塊培養(yǎng)。以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表達(dá);利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所得細(xì)胞中人EG細(xì)胞的比例。對(duì)原代培養(yǎng)第八天和第16天的細(xì)胞采用挑出傳代法、消化傳代法傳代培養(yǎng),其中消化傳代法使用的三種消化液分別是0.25%胰蛋白酶、0.5%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA。檢測(cè)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表達(dá)。 結(jié)果:原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)良好,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示,位于飼養(yǎng)層上的細(xì)胞及細(xì)胞集落陽(yáng)性表達(dá)SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明,培養(yǎng)體系中人EG細(xì)胞比例約為13%。原代培養(yǎng)至第八天時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛,適合于傳代;第16天時(shí),很多人EG細(xì)胞集落已分化或消散,喪失了傳代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作為消化液消化傳代人EG細(xì)胞所得的集落最多,效果最佳。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)表明,傳代培養(yǎng)第五代細(xì)胞仍保持SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論:組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)人胚胎生殖腺嵴和背側(cè)腸系膜所獲得的細(xì)胞為未分化的人EG細(xì)胞。最適宜的傳代時(shí)間是原代培養(yǎng)后第八天,最佳的傳代方法是胰蛋白酶-EDTA消化法,且傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞仍為未分化的人EG細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R321

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 董書偉;小鼠和人胚胎生殖細(xì)胞的分離與無(wú)血清培養(yǎng)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2515709