【摘要】：目的預(yù)測剛地弓形蟲尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,TgUPase)基因編碼蛋白的主要特性和抗原表位,克隆、表達TgUPase基因,并檢測其免疫反應(yīng)性。方法采用生物信息學在線分析程序和軟件預(yù)測TgUPase蛋白的理化性質(zhì)和抗原表位。提取RH株弓形蟲速殖子總RNA。根據(jù)TgUPase基因全長編碼序列(GenBank登錄號為DQ385446.1)的開放閱讀框設(shè)計引物,并用RT-PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pET-30a(+)載體。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)DH5α,陽性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定。將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3),并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍染色檢測表達產(chǎn)物,分別以抗His標簽抗體和人抗弓形蟲血清為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析重組蛋白及其免疫反應(yīng)性。結(jié)果生物信息學預(yù)測結(jié)果顯示,TgUPase蛋白由303個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量(Mr)為33 042.9,為可溶性蛋白,有3個潛在的T/B細胞聯(lián)合抗原表位。RT-PCR擴增產(chǎn)物約為921 bp。菌落PCR、雙酶切以及測序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得約Mr38 000的可溶性重組蛋白(帶His標簽)。Western blotting結(jié)果顯示,重組蛋白能被His標簽抗體和人抗弓形蟲血清識別。結(jié)論成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase,獲得剛地弓形蟲重組尿苷磷酸化酶,且重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
[Abstract]:Objective to predict the main characteristics and antigenic epitopes of uridine phosphorase (uridine phosphorylase,TgUPase) gene encoded by Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) gene, clone, express TgUPase gene and detect its immunogenicity. Methods the physical and chemical properties and epitopes of TgUPase protein were predicted by bioinformatics online analysis program and software. Extraction of Total RNA. from Toxoplasma gondii Toxozoites of RH strain According to the open reading frame of the full length coding sequence of TgUPase gene (GenBank accession number DQ385446.1), primers were designed and amplified by RT-PCR. The amplified products were ligated into pET-30a () vector after double enzyme digestion. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli (E.coli) DH5 偽. The positive colonies were identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl-尾-D-galactoside (IPTG). Sodium lauryl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with Coomassie brilliant blue staining was used to detect the expressed product. Anti-His labeled antibody and human anti-Toxoplasma gondii serum were used as the first antibody, respectively. The recombinant protein and its immunoreactivity were analyzed by Western imprinting (Western blotting). Results the bioinformatics prediction results showed that the TgUPase protein was composed of 303 amino acids and the relative molecular weight (Mr) was 33 042.9, which was soluble protein. There are three potential T / B cell combined antigenic epitopes. RT-PCR amplification product is about 921 bp. The results of double restriction enzyme digestion and sequencing of colony PCR, showed that the recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase was successfully constructed. The results of SDS-PAGE showed that about Mr38 000 soluble recombinant protein was obtained by IPTG induction (). Western blotting with His tag). The recombinant protein can be recognized by His label antibody and human anti-Toxoplasma gondii serum. Conclusion the recombinant uridine phosphorase of Toxoplasma gondii was successfully constructed by recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase, and the recombinant protein was immunoreactive.
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學生理學系 細胞生理學教育部重點實驗室;山西醫(yī)科大學醫(yī)學寄生蟲學研究所;太原師范學院生物系;
【基金】：國家自然科學基金(No.81071374) 山西省自然科學基金(No.2013011059-4)~~
【分類號】：R382.5

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本文編號：2497074