【摘要】：目的預(yù)測(cè)剛地弓形蟲(chóng)尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,TgUPase)基因編碼蛋白的主要特性和抗原表位,克隆、表達(dá)TgUPase基因,并檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。方法采用生物信息學(xué)在線分析程序和軟件預(yù)測(cè)TgUPase蛋白的理化性質(zhì)和抗原表位。提取RH株弓形蟲(chóng)速殖子總RNA。根據(jù)TgUPase基因全長(zhǎng)編碼序列(GenBank登錄號(hào)為DQ385446.1)的開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物,并用RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pET-30a(+)載體。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)DH5α,陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3),并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物,分別以抗His標(biāo)簽抗體和人抗弓形蟲(chóng)血清為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析重組蛋白及其免疫反應(yīng)性。結(jié)果生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,TgUPase蛋白由303個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為33 042.9,為可溶性蛋白,有3個(gè)潛在的T/B細(xì)胞聯(lián)合抗原表位。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為921 bp。菌落PCR、雙酶切以及測(cè)序結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得約Mr38 000的可溶性重組蛋白(帶His標(biāo)簽)。Western blotting結(jié)果顯示,重組蛋白能被His標(biāo)簽抗體和人抗弓形蟲(chóng)血清識(shí)別。結(jié)論成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a(+)-TgUPase,獲得剛地弓形蟲(chóng)重組尿苷磷酸化酶,且重組蛋白具有免疫反應(yīng)性。
[Abstract]:Objective to predict the main characteristics and antigenic epitopes of uridine phosphorase (uridine phosphorylase,TgUPase) gene encoded by Toxoplasma gondii (Toxoplasma gondii) gene, clone, express TgUPase gene and detect its immunogenicity. Methods the physical and chemical properties and epitopes of TgUPase protein were predicted by bioinformatics online analysis program and software. Extraction of Total RNA. from Toxoplasma gondii Toxozoites of RH strain According to the open reading frame of the full length coding sequence of TgUPase gene (GenBank accession number DQ385446.1), primers were designed and amplified by RT-PCR. The amplified products were ligated into pET-30a () vector after double enzyme digestion. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli (E.coli) DH5 偽. The positive colonies were identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl-尾-D-galactoside (IPTG). Sodium lauryl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with Coomassie brilliant blue staining was used to detect the expressed product. Anti-His labeled antibody and human anti-Toxoplasma gondii serum were used as the first antibody, respectively. The recombinant protein and its immunoreactivity were analyzed by Western imprinting (Western blotting). Results the bioinformatics prediction results showed that the TgUPase protein was composed of 303 amino acids and the relative molecular weight (Mr) was 33 042.9, which was soluble protein. There are three potential T / B cell combined antigenic epitopes. RT-PCR amplification product is about 921 bp. The results of double restriction enzyme digestion and sequencing of colony PCR, showed that the recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase was successfully constructed. The results of SDS-PAGE showed that about Mr38 000 soluble recombinant protein was obtained by IPTG induction (). Western blotting with His tag). The recombinant protein can be recognized by His label antibody and human anti-Toxoplasma gondii serum. Conclusion the recombinant uridine phosphorase of Toxoplasma gondii was successfully constructed by recombinant plasmid pET-30a ()-TgUPase, and the recombinant protein was immunoreactive.
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系 細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)研究所;太原師范學(xué)院生物系;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81071374) 山西省自然科學(xué)基金(No.2013011059-4)~~
【分類號(hào)】：R382.5

【參考文獻(xiàn)】

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8 申金雁;經(jīng)口感染弓形蟲(chóng)小鼠小腸IgA分泌細(xì)胞及抗體水平動(dòng)態(tài)變化[D];山西醫(yī)科大學(xué);2008年

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【二級(jí)參考文獻(xiàn)】

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