【摘要】： 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)的全能性使之成為再生醫(yī)學(xué)的最佳的種子細(xì)胞。在動物模型中已經(jīng)成功進(jìn)行了ESCs或其衍生物移植治療腦缺血的試驗研究,證明這種細(xì)胞能夠替代缺失的神經(jīng)元、修復(fù)神經(jīng)環(huán)路、重建突觸聯(lián)系并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),因而ESCs已逐漸成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞替代治療(cell replacement therapy,CRT)最受矚目的細(xì)胞。然而,這類細(xì)胞移植之后是被受者接受或整合還是被排斥,決定于受者體內(nèi)的免疫反應(yīng)機(jī)制,因而對這種機(jī)制的研究是十分必要的。以前人們認(rèn)為腦是“免疫赦免”器官(immunologically privileged site),認(rèn)為腦內(nèi)移植細(xì)胞能無限期存活,但這種觀點目前已被充分的事實證明打破。與此同時,有研究認(rèn)為不同種類的ESCs通常僅表達(dá)少量的主要組織相容性復(fù)合物I(major histocompatibility complex -I,MHC-I)而幾乎無MHC-II表達(dá),因而也賦予ESCs相當(dāng)?shù)摹懊庖咛貦?quán)(immune privilege)”,但也有越來越多的事實證明這種免疫特權(quán)也是相對的,作為移植物的ESCs在一定環(huán)境中同樣面臨著免疫攻擊的危險。因此針對ESCs免疫原性(immunogenicity)、移植免疫(transplantation immunity)以及移植免疫抑制(immunodepression)或耐受(immunotolerance)途徑的研究應(yīng)該受到重視。本試驗初步探討了ES-D3 ESCs及其誘導(dǎo)衍生物神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cell,NPC)的免疫原性及移植免疫現(xiàn)象,并試圖通過同源的衍生細(xì)胞  胚胎干細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞(embryonic stem cell derived dendrtic cell,esDC)的聯(lián)合移植來誘導(dǎo)對植入的NPC同種耐受。 第一部分體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的分化 目的運(yùn)用“五步”法誘導(dǎo)ES-D3系鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)向NPCs分化。 方法分化前ESCs在明膠瓶中傳代培養(yǎng)去處滋養(yǎng)層,在培養(yǎng)基中加入1000u/ml重組白血病抑制因子(rLIF)阻止ESCs分化。單細(xì)胞懸液在去除rLIF的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4d以形成擬配體(EB),轉(zhuǎn)入無血清ITSF培養(yǎng)基培養(yǎng)6d富集nstin陽性細(xì)胞,在有絲分裂原堿性成纖維生長因子(bFGF)作用下擴(kuò)增6d,撤銷bFGF后在煙酰胺作用下誘導(dǎo)出神經(jīng)樣細(xì)胞。共計經(jīng)過5個步驟。 結(jié)果經(jīng)由無血清培養(yǎng)基可獲得約80%以上的Nestin染色陽性NPCs,該細(xì)胞bFGF存在的情況下可反復(fù)傳代與擴(kuò)增。當(dāng)去處bFGF后在煙酰胺的作用下,這些細(xì)胞可分化出GFAP或Tuj-1陽性的神經(jīng)樣細(xì)胞。 結(jié)論本實驗從ESCs中誘導(dǎo)出nestin染色陽性的NPC,為進(jìn)一步的神經(jīng)生物學(xué)研究和細(xì)胞移植治療提供了充足的細(xì)胞來源。 第二部分神經(jīng)前體細(xì)胞的免疫原性及向腦缺血大鼠腦內(nèi)移植免疫學(xué)現(xiàn)象觀察 目的觀察體外mESCs和NPCs的免疫原性及NPCs腦內(nèi)移植之后的免疫學(xué)現(xiàn)象。 方法 1運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測ES-D3 mESCs細(xì)胞及其衍生NPCs細(xì)胞表面MHC-I、MHC-II的組成型表達(dá),并在20ng/mlγ干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)作用下觀察NPCs細(xì)胞表面MHC-I、MHC-II誘導(dǎo)型表達(dá)情況。 2建立MCAo模型并分組: I組,MCAo+NPC移植II組,MCAo+PBS(-)注射III組,MCAo(無處理) IV組,sham+NPC移植V組,sham+PBS(-)注射VI組,sham(無處理) 在術(shù)后(MCAo或者sham)兩周行側(cè)腦室NPCs移植。移植后兩周取頸部淋巴結(jié)行淋巴細(xì)胞與NPCs共培養(yǎng),MTT法觀察淋巴細(xì)胞的增殖情況。免疫組化檢測腦局部巨噬細(xì)胞標(biāo)志物ED1及淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD4、CD8分子的表達(dá)情況。 結(jié)果 1 ES-D3 ESCs在未分化前表面少量表達(dá)MHC-I但無MHC-II表達(dá),經(jīng)誘導(dǎo)分化成NPCs后MHC II分子表達(dá)無增高但MHC-I上升顯著,運(yùn)用IFN-γ誘導(dǎo)NPCs,其表面MHC-I進(jìn)一步上調(diào)而MHC-II也輕度上調(diào)。 2頸淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)檢測顯示相比sham組,MCAo組(I、II、III組)PI值增高(P0.05)其中以接受NPCs移植的I組最高,但MCAo組間差異未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。sham組(IV、V、VI組)各組間PI亦無顯著差別。 3腦內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤:在sham組(IV、V、VI組)小鼠中和移植針道周圍在少量CD4、CD8陽性細(xì)胞和ED1陽性細(xì)胞。而在MCAo組(I、II、III組)大鼠腦內(nèi)的可見多量的炎性細(xì)胞浸潤。其中,CD4陽性細(xì)胞在皮質(zhì)(P0.01)和紋狀體都顯著升高(P0.01),在缺血皮質(zhì),組間CD4陽性細(xì)胞差別不顯著,但在紋狀體,接受NPCs移植的I組大鼠顯示異常的CD4陽性細(xì)胞浸潤(P0.01)。相比sham組,MCAo組大鼠CD8陽性細(xì)胞在皮質(zhì)(P0.05)和紋狀體都顯著升高(P0.05),但MCAo各組間以及皮質(zhì)和紋狀體間差異不顯著(P0.05)。ED1陽性細(xì)胞的反應(yīng)模式與CD4一致,在紋狀體內(nèi)顯示更高的表達(dá)且在I組大鼠中差異達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。意外的是,在接受NPCs移植的sham組中,紋狀體區(qū)ED1陽性表達(dá)卻有異常增高趨勢(P0.01)。 結(jié)論:ESCs表達(dá)少量MHC-I類分子但不組成型表達(dá)MHC-II類分子;分化成NPCs后顯著表達(dá)MHC-I類分子而MHC-II表達(dá)無變化,但在IFN-γ的作用下可上調(diào)MHC-I和MHC-II類分子,提示這些細(xì)胞本身可誘導(dǎo)針對MHC-I類分子的排斥反應(yīng),而在腦內(nèi)的炎癥環(huán)境中有可能進(jìn)一步誘導(dǎo)針對MHC-II類分子的免疫反應(yīng)。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和腦內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤模式提示腦缺血損傷本身是腦內(nèi)免疫學(xué)激活的重要原因,而腦內(nèi)炎性細(xì)胞亞型有差別的反應(yīng)模式,如在NPCs移植大鼠紋狀體內(nèi)異常的CD4和ED1高表達(dá)提示可能存在針對移植細(xì)胞的排斥,包括CD4+Th1途徑的活化及局部活躍的抗原引流。 第三部分ES-D3鼠胚胎干細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 目的直接從mESCs誘導(dǎo)分化出esDCs。 方法分化前ESCs在明膠瓶中傳代培養(yǎng)去處滋養(yǎng)層,在培養(yǎng)基中加入1000u/ml rLIF阻止ESCs分化。單細(xì)胞懸液在去除rLIF的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)形成EB。取第14天的EB在含25 ng/ml重組鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和10ng /ml重組鼠白細(xì)胞介素-3(rmIL-3)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天。運(yùn)用流式細(xì)胞計數(shù)儀檢測誘導(dǎo)細(xì)胞表面CD11c、MHC-I、MHC-II、CD86、CD80、CD83的表達(dá)情況。同時,運(yùn)用脂多糖(LPS)刺激誘導(dǎo)細(xì)胞,觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MHC-II、CD80分子表達(dá)變化,并利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)觀察其對同種淋巴細(xì)胞的刺激能力。 結(jié)果在rmGM-CSF和rmIL-3細(xì)胞因子的作用下,EBs在培養(yǎng)第4天開始出現(xiàn)大量早期的esDCs,在接下來的培養(yǎng)中細(xì)胞大量擴(kuò)增。常規(guī)消化后這些細(xì)胞保持很高的增殖活性,更換新鮮培養(yǎng)基后細(xì)胞增殖活性無變化。流式細(xì)胞儀檢測這些細(xì)胞表達(dá)高量的CD11c、低量的MHC-I,而不表達(dá)CD86、CD80、CD83及MHC-II,說明該細(xì)胞系不成熟的DCs(immature DC,imDC)。但當(dāng)用LPS刺激作用后,該類細(xì)胞表現(xiàn)出成熟DCs(mature DC,mDC)的細(xì)胞形態(tài)并上調(diào)MHC-II、CD80分子,同時產(chǎn)生對同種淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈的刺激作用(P0.05),但未經(jīng)LPS刺激的細(xì)胞則沒有明顯的同種淋巴細(xì)胞刺激作用(P0.05)。 結(jié)論運(yùn)用EB聯(lián)合細(xì)胞因子rmGM-CSF和rmIL-3能從ESCs中直接誘導(dǎo)分化出esDCs,為大量獲得耐受性imDCS開辟了新的途徑。 第四部分胚胎干細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞在同源性神經(jīng)前體細(xì)胞腦內(nèi)移植耐受中的作用 目的用esDCs誘導(dǎo)針對同一來源NPCs腦內(nèi)移植的免疫耐受。 方法 1運(yùn)用pCX-eGFP轉(zhuǎn)染的ESCs誘導(dǎo)分化表達(dá)GFP的NPCs 2動物MCAo模型并分組: I組:MCAo+NPCs移植組II組:MCAo+esDCs預(yù)處理+NPCs移植組 兩組動物在手術(shù)后兩周接受pCX-EGFP NPCs移植,II組則在接受移植前一周接受esDCs的皮下注射。移植兩周后觀察移植細(xì)胞的存活率、頸部淋巴結(jié)增殖率、腦局部免疫學(xué)分子ED1、CD4、CD8分子的表達(dá)、RT-PCR檢測腦缺血半球TGF-β、IL-10的表達(dá)情況。 結(jié)果運(yùn)用esDCS能明顯抑制紋狀體內(nèi)CD4陽性細(xì)胞浸潤,但對其他炎性細(xì)胞浸潤、移植細(xì)胞存活、頸部淋巴細(xì)胞增殖以及腦局部細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10的分泌則無影響。 結(jié)論esDCs預(yù)處理能減輕紋狀體內(nèi)的CD4陽性細(xì)胞浸潤,有可能在以CD4+T細(xì)胞反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)中誘導(dǎo)耐受,但缺乏相關(guān)的證據(jù)表明該過程是通過細(xì)胞因子依賴性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)來實現(xiàn)。且在該移植時間點上,esDCs預(yù)處理并沒有對移植物存活產(chǎn)生明顯影響,有關(guān)esDCs誘導(dǎo)耐受的作用尚待進(jìn)一步研究。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 吳旋,黎海蒂,李樹濃,徐海偉,徐令;小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)前體細(xì)胞的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2001年11期

2 劉述,謝瑤,陳系古,姚志彬;小鼠胚胎干細(xì)胞植入大鼠腦內(nèi)分化的研究(英文)[J];中國臨床康復(fù);2003年16期

3 徐海偉,吳旋,黎海蒂,范曉棠,曹娟,唐軍;纖維連接蛋白在小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞中的作用(英文)[J];中國臨床康復(fù);2003年23期

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本文編號：2496923