【摘要】：目的 1．血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建 2．血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3基因的原核融合表達(dá) 方法 以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的克隆質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)合適引物，在上游引物中加入酶切位點(diǎn)和起始密碼，在下游引物中加入終止密碼和酶切位點(diǎn)，，把上述VEGFR3擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后與pBV220質(zhì)粒經(jīng)雙酶切純化后的產(chǎn)物連接，把該質(zhì)粒命名為pBV220-VEGFR3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選出陽(yáng)性菌株，溫控誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破菌，對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌純化。以pBV220-VEGFR3為模板通過(guò)PCR方法構(gòu)建C端含有HisTag的pBV220-VEGFR3his質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用Western-blotting鑒定，用Ni~(2+)-NTA樹(shù)脂柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。 結(jié)果 構(gòu)建了pBV220-VEGFR3質(zhì)粒表達(dá)載體，SDS-PAGE電泳表明在大腸桿菌DH5α中成功表達(dá)出VEGFR3因子，同時(shí)構(gòu)建了pBV220-VEGFR3融合表達(dá)載體，SDS-PAGE電泳和Western-blotting結(jié)果表明在大腸桿菌DH5α中成功表達(dá)出VEGFR3融合蛋白，用Ni~(2+)-NTA樹(shù)脂柱純化后獲得VEGFR3融合蛋白純品。 結(jié)論 應(yīng)用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了pBV220-VEGFR3質(zhì)粒表達(dá)載體，表達(dá)純化出蛋白，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective 1. Construction of prokaryotic expression vector of vascular endothelial growth factor receptor-3 gene. The prokaryotic fusion expression method was based on the cloned plasmid constructed in our laboratory as template. Appropriate primers were designed, enzyme digestion sites and initial codes were added to upstream primers, termination codes and enzyme digestion sites were added to downstream primers, and the VEGFR3 amplification products were recovered and purified by gel cutting and linked to the products purified by double enzyme digestion of pBV220 plasmid. The plasmid was named pBV220-VEGFR3, and transformed into E. coli DH5 偽. The positive strain was screened out, the expression was induced by temperature control, the inclusion body was washed and purified by ultrasonic broken bacteria. Using pBV220-VEGFR3 as template, the pBV220-VEGFR3his plasmid containing HisTag at C terminal was constructed by PCR and transformed into E. coli DH5 偽. The expressed product was identified by Western-blotting and purified by Ni~ (2)-NTA resin column. Results pBV220-VEGFR3 plasmid expression vector was constructed. SDS-PAGE electrophoresis showed that VEGFR3 factor was successfully expressed in E. coli DH5 偽, and pBV220-VEGFR3 fusion expression vector was constructed at the same time. The results of SDS-PAGE electrophoresis and Western-blotting showed that the VEGFR3 fusion protein was successfully expressed in E. coli DH5 偽. The pure VEGFR3 fusion protein was purified by Ni~ (2)-NTA resin column. Conclusion pBV220-VEGFR3 plasmid expression vector was successfully constructed by genetic engineering technique, and the protein was expressed and purified, which laid a foundation for further research.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R346

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