【摘要】：第一部分 骨髓基質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定 目的：觀察大鼠骨髓基質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)的條件及生物學(xué)特性并加以鑒定。 方法：取SD大鼠骨髓，分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，傳代后觀察其生長特性，，用流式細胞方法加以鑒定。 結(jié)果：使用全骨髓細胞培養(yǎng)法，在含20％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)，原代培養(yǎng)3-5d后，BMSC開始克隆生長，10-14d達到90％融合。傳代培養(yǎng)至第6代，BMSC生長形態(tài)相對穩(wěn)定，以梭形細胞為主，倍增時間約4天，90％融合時間約為10d。流式細胞檢測第6代BMSC高表達BMSC標志CD90(99.7％)，而不表達造血細胞標志CD45表達陰性，純度較高。 結(jié)論：使用全骨髓細胞培養(yǎng)法，在含20％胎牛血清的L-DMEM條件下培養(yǎng)，是分離培養(yǎng)BMSC的簡單、快速方法，并可獲得較高的純度。 第二部分 骨髓基質(zhì)干細胞體外向腸神經(jīng)誘導(dǎo)分化 目的 探討不同方法誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分化腸神經(jīng)細胞的可能性，并探索適宜的誘導(dǎo)方法。 方法 體外培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)。傳代至第六代后，進行神經(jīng)誘導(dǎo)分化。先以bFGF(10ng／ml)預(yù)誘導(dǎo)24h，然后分6組誘導(dǎo)：1)GDNF組 以膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF，10ng／ml)，在胎腸培養(yǎng)基(FGCM)條件下誘導(dǎo)10天；2)維甲酸組 維甲酸、鋅和FGCM誘導(dǎo)10天。3)GDNF、維甲酸、鋅聯(lián)合FGCM組4)單用GDNF組；5)單用FGCM組；6)DMEM對照組。并觀察GDNF誘導(dǎo)的量效、時效關(guān)系，以及撤去誘導(dǎo)劑后神經(jīng)表型的變化。免疫熒光法檢測神經(jīng)元標志神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NF)，膠質(zhì)細胞標志膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，以及腸神經(jīng)標志蛋白基因產(chǎn)物(PGP9.5)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)。 結(jié)果 1)流式細胞檢測BMSC高表達BMSC標志CD90，而不表達造血細胞標志CD45表達陰性。2)誘導(dǎo)10天后，各組不同程度部分細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出神經(jīng)元樣改變，免疫熒光染色NSE、NF、PGPG9.5、NOS陽性，GFAP染色陰性。3)GDNF組NF、PGPG9.5、NOS陽性比例顯著高于維甲酸組(p＜0.05)及單用GDNF或FGCM組。4)GDNF誘導(dǎo)存在量效和時效關(guān)系。5)撤去誘導(dǎo)劑后神經(jīng)標志表達逐漸下降。 結(jié)論 BMSC可在體外被誘導(dǎo)分化為腸神經(jīng)樣細胞，GDNF在胎腸培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)腸神經(jīng)樣細胞比例高于維甲酸等的誘導(dǎo)。撤去誘導(dǎo)劑后，腸神經(jīng)元表型不能長期維持。 第三部分 骨髓基質(zhì)干細胞分化后腸神經(jīng)遞質(zhì)的表達 目的 探討骨髓基質(zhì)干細胞體外向腸神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)后腸神經(jīng)遞質(zhì)的表達和分泌。 方法 體外培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)。傳代至第六代后，進行神經(jīng)誘導(dǎo)分化。先以bFGF(10ng／ml)預(yù)誘導(dǎo)24h，然后分兩組誘導(dǎo)：1)GDNF組 以膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF，10ng／ml)，在胎腸培養(yǎng)基(FGCM)條件下誘導(dǎo)10天；2)維甲酸組 維甲酸(Vitamin A acid，VA，0.5mM)、鋅(10μM)和FGCM誘導(dǎo)10天。免疫熒光法檢測腸神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮的合成酶(nitric oxide synthase，NOS)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和P物 質(zhì)(substance P，SP)。并用硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)液一氧化氮(nitric oxide，NO)水平。結(jié)果1)誘導(dǎo)10天后，GDNF組和維甲酸組均有部分細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出神經(jīng)元樣改變，免疫熒光染色NOS、VIP陽性，SP、ACh表達水平較低，且GDNF組陽性率較維甲酸組高。2)兩組培養(yǎng)液均可檢測到NO，誘導(dǎo)10天后的濃度高于6天后的濃度，GDNF組高于維甲酸組。 結(jié)論 BMSC可在體外被誘導(dǎo)分化為腸神經(jīng)樣細胞并表達腸神經(jīng)遞質(zhì)。 第四部分 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分化前后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達 目的 探討大鼠骨髓基質(zhì)干細胞分化前后神經(jīng)生長因子表達的變化。 方法 體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)，傳代至第6代，進行神經(jīng)誘導(dǎo)分化。先以bFGF(10ng／ml)預(yù)誘導(dǎo)24h，然后以膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF，10ng／ml)或維甲酸、Zn在胎腸培養(yǎng)基(FGCM)條件下誘導(dǎo)10d。免疫熒光法檢測腸神經(jīng)元標志的表達。RT-PCR法檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF和神經(jīng)生長因子(NGF)mRNA的表達。 結(jié)果 誘導(dǎo)10天后，部分細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出神經(jīng)元樣改變，免疫熒光染色腸神經(jīng)元標志陽性。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BMSC誘導(dǎo)前低表達神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和GDNF mRNA，而誘導(dǎo)后表達水平顯著增加。 結(jié)論 GDNF不僅能在體外誘導(dǎo)BMSC分化為腸神經(jīng)樣細胞，而且能促進神經(jīng)營養(yǎng)因子表達顯著增加。 第五部分 骨髓基質(zhì)干細胞腸神經(jīng)元分化機制的初步研究 目的 初步探討骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cell，BMSC)腸神經(jīng)分化的機制。 方法 體外原代培養(yǎng)胎腸細胞，檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子膠質(zhì)細胞細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF和神經(jīng)生長因子NGF的表達，并制備胎腸條件培養(yǎng)基(Fetal gut condition medium，F(xiàn)GCM)。觀察GDNF受體GDNFRα1的抗體對GDNF、FGCM誘導(dǎo)BMSC腸神經(jīng)分化的影響，以及RET基因mRNA的表達變化。 結(jié)果 胎腸原代培養(yǎng)細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF和NGF。GDNF、FGCM誘導(dǎo)BMSC腸神經(jīng)分化后RET基因mRNA的表達上調(diào)。GDNFRα1的抗體可抑制BMSC腸神經(jīng)分化，并下調(diào)RET基因mRNA的表達。 結(jié)論 GDNF可能在胎腸培養(yǎng)基提供的腸神經(jīng)元發(fā)育微環(huán)境下，通過上調(diào)RET表達激活GDNF-RET信號通路，從而誘導(dǎo)BMSC向腸神經(jīng)元細胞分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2469650