目的抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體及其雙價抗體(BsFv)的構建,表達及其與細胞結合的活性與特異性鑒定。 方法 1.通過酶切與亞克隆構建抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體(scFv); 2.以抗轉鐵蛋白受體scFv為模板,設計引物引入中間連接肽(G4S)及酶切位點AscI,通過PCR方法擴增出兩個scFv片段,將其連接,并克隆至原核表達載體pAB1,將其轉化大腸桿菌TG1,挑取單克隆細菌進行擴增,提取質粒酶切、測序鑒定; 3.IPTG誘導單鏈抗體及其雙價抗體表達,Ni-NTA層析柱純化抗體,收集純化產物經SDS-PAGE分析,Western blot鑒定; 4.通過FCM測定純化單鏈抗體及其雙價抗體與細胞結合特異性與活性。 結果 1.隨機挑選轉化板上的菌落提取質粒,SfiI、NotI酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見一條約750bp和1500bp的陽性條帶,分別與單鏈抗體和雙價抗體基因大小理論值符合。雙價抗體測序結果與原單鏈抗體以及PCR引物比對正確。證明抗TfR單鏈抗體和雙價抗體構建成功,并均已克隆至分泌性表達載體pAB1中; 2.IPTG誘導單鏈抗體及其雙價抗體表達,可溶性蛋白純化后經SDS-PAGE分析,Western blot檢測,可見約30KD和60KD大小的條帶,分別與單鏈抗體和雙價抗體理論值一致; 3.將純化的單鏈抗體,雙價抗體分別與K562,HepG2,靜止外周血淋巴細胞進行結合,FCM檢測與細胞結合的陽性率結果顯示,雙價抗體與K562結合的陽性率約60%左右,與HepG2結合的陽性率為23%左右,高于單鏈抗體,且單鏈抗體,雙價抗體與靜止外周血淋巴細胞結合陽性率基本一致。表明構建的抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體與雙價抗體均具有與K562及Hela細胞表面TfR結合的特異性,雙價抗體親合力較單鏈抗體有所提高。 結論成功構建與表達抗TfR的單鏈抗體與雙價抗體,并證明其具有與K562,HepG2細胞表面TfR結合的活性及特異性,雙價抗體親合力較單鏈抗體有所增強。.為抗TfR的單鏈抗體與雙價抗體用于細胞表面TfR與可溶性TfR的檢測,以及靶向研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 顏冰,朱恒奇,黃培堂;抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體的可溶性表達及其對腦的靶向性研究[J];生物工程學報;2004年03期

2 朱慧芬,楊道鋒,沈關心,周春;抗轉鐵蛋白受體單鏈抗體原核表達載體的構建和表達[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2004年04期

3 葉慶,王志華,朱慧芬,王碩,沈關心;抗CD71人-鼠嵌合抗體對活化淋巴細胞的效應[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年07期

本文編號：2437035