目的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體及其雙價(jià)抗體(BsFv)的構(gòu)建,表達(dá)及其與細(xì)胞結(jié)合的活性與特異性鑒定。 方法 1.通過酶切與亞克隆構(gòu)建抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體(scFv); 2.以抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體scFv為模板,設(shè)計(jì)引物引入中間連接肽(G4S)及酶切位點(diǎn)AscI,通過PCR方法擴(kuò)增出兩個(gè)scFv片段,將其連接,并克隆至原核表達(dá)載體pAB1,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1,挑取單克隆細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增,提取質(zhì)粒酶切、測序鑒定; 3.IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體及其雙價(jià)抗體表達(dá),Ni-NTA層析柱純化抗體,收集純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,Western blot鑒定; 4.通過FCM測定純化單鏈抗體及其雙價(jià)抗體與細(xì)胞結(jié)合特異性與活性。 結(jié)果 1.隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的菌落提取質(zhì)粒,SfiI、NotI酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見一條約750bp和1500bp的陽性條帶,分別與單鏈抗體和雙價(jià)抗體基因大小理論值符合。雙價(jià)抗體測序結(jié)果與原單鏈抗體以及PCR引物比對(duì)正確。證明抗TfR單鏈抗體和雙價(jià)抗體構(gòu)建成功,并均已克隆至分泌性表達(dá)載體pAB1中; 2.IPTG誘導(dǎo)單鏈抗體及其雙價(jià)抗體表達(dá),可溶性蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE分析,Western blot檢測,可見約30KD和60KD大小的條帶,分別與單鏈抗體和雙價(jià)抗體理論值一致; 3.將純化的單鏈抗體,雙價(jià)抗體分別與K562,HepG2,靜止外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合,FCM檢測與細(xì)胞結(jié)合的陽性率結(jié)果顯示,雙價(jià)抗體與K562結(jié)合的陽性率約60%左右,與HepG2結(jié)合的陽性率為23%左右,高于單鏈抗體,且單鏈抗體,雙價(jià)抗體與靜止外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合陽性率基本一致。表明構(gòu)建的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體與雙價(jià)抗體均具有與K562及Hela細(xì)胞表面TfR結(jié)合的特異性,雙價(jià)抗體親合力較單鏈抗體有所提高。 結(jié)論成功構(gòu)建與表達(dá)抗TfR的單鏈抗體與雙價(jià)抗體,并證明其具有與K562,HepG2細(xì)胞表面TfR結(jié)合的活性及特異性,雙價(jià)抗體親合力較單鏈抗體有所增強(qiáng)。.為抗TfR的單鏈抗體與雙價(jià)抗體用于細(xì)胞表面TfR與可溶性TfR的檢測,以及靶向研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 顏冰,朱恒奇,黃培堂;抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的可溶性表達(dá)及其對(duì)腦的靶向性研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2004年03期

2 朱慧芬,楊道鋒,沈關(guān)心,周春;抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年04期

3 葉慶,王志華,朱慧芬,王碩,沈關(guān)心;抗CD71人-鼠嵌合抗體對(duì)活化淋巴細(xì)胞的效應(yīng)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年07期

本文編號(hào)：2437035