【摘要】： 結核病(Tuberculosis , TB)是由結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病,目前全球有1/3人口感染MTB,每年的新發(fā)病例約1 000萬,每年約300萬人因TB死亡。我國TB患者數(shù)量居世界第二位,據(jù)2000年全國TB流行病調查,我國現(xiàn)有MTB感染人數(shù)5億,患者5 000萬人,每年死于TB的人數(shù)達25.6萬�？ń槊�(BCG)是目前唯一的預防TB的疫苗,但其保護效果不穩(wěn)定(保護率為0~80%),同時由于MTB的耐藥菌株的流行與HIV的合并感染以及人口流動增加等因素,進一步加劇了MTB對人類的威脅。因此,積極研究MTB的致病及免疫機制,研制更為有效的診斷、預防和治療MTB感染的新技術、新方法、新疫苗等具有重要意義。 復活促進因子(Resuscitation promoting factor,Rpf)最早在藤黃微球菌(Micrococcus luteus)中發(fā)現(xiàn),它可以促進休眠期MTB的生長。Rpf樣蛋白廣泛存在于革蘭陽性菌中,并與革蘭陽性菌生物活性相關。MTB Rpf家族有五種蛋白,分別是Rv0867c、Rv1009c、Rv1884c、Rv2389c和Rv2450c。對Rpf家族的研究發(fā)現(xiàn),Rpf樣蛋白不僅與細菌的增殖有關,還有可能是宿主免疫系統(tǒng)識別的一個靶抗原。在本研究中,我們分別在大腸埃希菌(E. coli)和母牛分枝桿菌(M. vaccae)中表達并純化了Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c融合蛋白,研究了這些融合蛋白刺激細菌增殖功能的作用機理和本身的免疫學特性,評價其作為快速培養(yǎng)檢驗MTB和新的TB基因工程疫苗或亞單位疫苗的候選組分的可能性。 實驗方法和結果: 1.MTB Rpf樣蛋白的表達與純化 根據(jù)GenBank公布的MTB H37Rv株Rpf家族基因Rv1884c和Rv2389c全長cDNA序列,借助計算機軟件PrimerPremier 5.0設計了含有相同酶切位點的4條引物。采用PCR方法以MTB H37Rv株的基因組DNA為模板分別擴增出相應大小的目的片段。將不同的目的基因片段分別克隆入載體pGEM-T-easy中,將其與pGEM-T-easy-Rv0867c一起進行測序,結果與GenBank報道的完全一致。將測序正確的Rv0867c克隆入表達載體pET19b,重組入E. coli DE3菌株中表達;Rv1884c和Rv2389c片段分別克隆入表達載體pPRO-EXHT-B和分枝桿菌穿梭載體pDE-22中,酶切鑒定陽性重組子,分別重組入E. coli DH5α和M. vaccae中,并通過IPTG或熱誘導進行誘導表達。SDS-PAGE分析的結果表明成功地表達出了相應的5種融合蛋白:Rv0867c(E)、Rv1884c(E)、Rv1884c(M)、Rv2389c(E)和Rv2389c(M);用6×His的單克隆抗體進行Western-blot分析的結果也顯示在相應條帶處有特異性的陽性反應,其分子量與各自蛋白的預計大小相符或不相符。隨后采用Ni2+-NTA親和色譜柱純化得到了5種融合蛋白,定量后保存于-20℃。 2.MTB Rpf樣蛋白的生物學及免疫學活性研究 2.1 Rpf樣蛋白的生物學活性研究 復制結核休眠菌模型成功后,取適宜稀釋度的休眠狀態(tài)的MTB H37Ra株培養(yǎng)液分為5組,分別加入純化的融合蛋白,37℃培養(yǎng)。每五天分別取少量培養(yǎng)液測OD600值,根據(jù)測定結果繪制不同劑量融合蛋白對于MTB生長的曲線圖。確定各組蛋白的最佳濃度后,將休眠狀態(tài)的MTB H37Ra株隨機分為3組,分別加入最佳濃度的Rv0867c(E)與相應的兔抗Rv0867c(E)多抗血清;最佳濃度的Rv2389c(E)、Rv2389c(M)與相應的兔抗Rv2389c(E)多抗血清,37℃培養(yǎng)。每五天分別取少量培養(yǎng)液測OD600值,根據(jù)測定結果繪制MTB生長的曲線圖。結果表明,Rv0867c和Rv2389c融合蛋白可以促進MTB H37Ra的快速復蘇,而且在M. vaccae中表達的比E. coli表達的Rv2389c融合蛋白有著更強的復蘇刺激作用;兩種系統(tǒng)表達的Rv1884c融合蛋白對MTB的復蘇均沒有作用。MTB的復蘇與加入的Rpf融合蛋白不呈劑量依賴性關系。制備的兩種兔多抗血清在適宜的滴度可以完全抑制兩種蛋白的復蘇刺激作用。 2.2 Rpf樣蛋白的免疫學活性研究 取預先轉移到硝酸纖維素膜上的5種純化的Rpf樣蛋白,采用皮下包埋的方法免疫小鼠三次,每次間隔2周。用各自的純化蛋白作為抗原,以ELISA方法測定免疫小鼠血清中的特異性抗體滴度。結果Rv0867c免疫小鼠的抗體滴度平均為1∶1600;M. vaccae表達的Rv1884c免疫小鼠的抗體滴度平均為1∶400;E. coli DH5α表達的Rv1884c免疫小鼠的抗體滴度平均為1∶200;M. vaccae表達的Rv2389c免疫小鼠的抗體滴度平均為1∶200;E. coli DH5α表達的Rv2389c免疫小鼠的抗體滴度平均為1∶800。 為了檢測Rpf樣蛋白免疫小鼠引起的細胞免疫應答,最后一次免疫完成兩周后,分離各組免疫小鼠的脾淋巴細胞,經(jīng)PPD刺激后,分別用MTT法進行淋巴細胞增殖實驗以及用ELISA夾心法檢測IFN-γ和IL-2。 淋巴細胞增殖實驗的結果表明,5種Rpf融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴細胞增殖以Rv0867c免疫組最為顯著,其刺激指數(shù)為3.57,明顯高于生理鹽水對照組(P0.05),但與BCG免疫組相比仍有較大差距(P0.05);其次為E. coli DH5α表達的Rv2389免疫組,為2.64,而M. vaccae表達的Rv2389c免疫組的刺激指數(shù)為2.08,兩者均高于生理鹽水對照組(P0.05);M. vaccae表達的和E. coli DH5α表達的Rv1884免疫組的刺激指數(shù)分別為1.14和1.39,與生理鹽水陰性對照組淋巴細胞的增殖指數(shù)相當(P0.05)。 兩種細胞因子檢測的結果表明,(1)Rv0867c融合蛋白免疫組IFN-γ水平為613.55±73.71ng/L,IL-2水平為477.62±45.92ng/L,均明顯高于生理鹽水對照組(P0.05),說明Rv0867c融合蛋白可誘導小鼠產(chǎn)生獲得性免疫反應,但是作為單一抗原,其誘生的細胞因子水平與BCG相比還是有一定差距(P0.05)。(2)E. coli DH5α表達的和M. vaccae表達的Rv2389c免疫組的IFN-γ含量分別為401.01±43.46ng/L和388.58±30.92ng/L,高于生理鹽水對照組(P0.05),但與Rv0867c融合蛋白免疫組IFN-γ水平相比有差距(P0.05);兩個系統(tǒng)表達的Rv1884c免疫組的IFN-γ含量分別為133.76±22.53ng/L和149.61±20.06ng/L,均與生理鹽水陰性對照相當(P0.05)。(3)E. coli DH5α表達的和M. vaccae表達的Rv2389c免疫組的IL-2含量分別為275.49±25.53ng/L和291.29±15.41ng/L,高于生理鹽水對照組(P0.05),但與Rv0867c融合蛋白免疫組IL-2水平相比有差距(P0.05);兩個系統(tǒng)表達的Rv1884c免疫組的IL-2含量分別為120.61±4.65ng/L和114.93±20.58ng/L,均與生理鹽水陰性對照相當(P0.05)。無論是E. coli表達還是M. vaccae表達,Rv1884c融合蛋白均只能刺激產(chǎn)生少量的IFN-γ和IL-2。 在免疫完成后第二周,用106CFU的MTB H37Rv株經(jīng)尾靜脈攻擊上述各組免疫小鼠,四周后處死小鼠并計數(shù)脾臟的荷菌數(shù)。結果表明,與生理鹽水對照組相比較,Rv0867c融合蛋白免疫組小鼠對毒株攻擊后在脾臟中的增殖有顯著抵抗作用,但仍不如BCG免疫組提供的保護作用有效;E. coli DH5α表達的和M. vaccae表達的Rv2389c融合蛋白免疫可以提供微弱的保護作用;而E. coli DH5α表達的和M. vaccae表達的Rv1884c融合蛋白免疫沒有保護作用。 結論:MTB的Rpf樣蛋白Rv0867c和Rv2389c蛋白具有促進休眠的MTB復蘇的作用,同時Rv0867c蛋白免疫動物后還可誘導產(chǎn)生特異性的細胞免疫應答和保護性反應。因而它們有可能用做臨床標本分離培養(yǎng)過程中的添加劑;同時它們也有可能作為新的TB基因工程疫苗或亞單位疫苗的候選組分,值得進一步深入研究。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R378;R392

【參考文獻】

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1 孔忠順,管波清,古淑香,馬s，

本文編號：2427178