發(fā)布時(shí)間：2018-12-15 08:04

【摘要】：人LAK細(xì)胞(lymphocyte-activated killer cells，淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)／NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體抗瘤細(xì)胞系統(tǒng)和抗胞內(nèi)微生物感染的主要免疫細(xì)胞群體。LAK中存在多種具有殺菌作用的活性物質(zhì)，已經(jīng)在LAK細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素、LL-37、α-防御素等抗菌分子。LAK細(xì)胞中是否還有其它內(nèi)源性抗菌肽尚不清楚。 將rIL-2、PHA刺激培養(yǎng)一周的人LAK細(xì)胞用5％的乙酸勻漿，制備酸溶性粗提物。AU-PAGE及電泳凝膠瓊脂糖彌散法檢測(cè)出其中含有三組殺菌多肽成分，分別命名為HLP-1、HLP-2、HLP-3。利用制備性AU-PAGE電泳技術(shù)初步分離獲得這三個(gè)組分。將這三個(gè)組分用反向高效液相色譜技術(shù)進(jìn)一步分離純化，瓊脂糖彌散法篩選純化各組分的抗菌活性，較強(qiáng)抗菌活性的組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳初步測(cè)定分子量及純度。選擇高度純化的蛋白組分HLP-3p21，采取Edman降解法測(cè)定其氮端氨基酸序列，得到HLP-3p21的N-端10個(gè)氨基酸序列，分別為：脯氨酸(Pro，，P)，賴(lài)氨酸(Lys，K)，精氨酸(Arg，R)，賴(lài)氨酸(Lys，K)，丙氨酸(Ala，A)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，天冬氨酸(Asp，D)丙氨酸(Ala，A)，賴(lài)氨酸(Lys，K)。將該段氨基酸序列登錄美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(NCBI)，應(yīng)用Blast檢索工具進(jìn)行短序列匹配的人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)：這段序列與人非組蛋白HMGN2的氮端氨基酸序列完全相同。對(duì)HLP-3p21進(jìn)行質(zhì)譜精確分子量分析，其分子量為9274.04 Da，也與HMGN2相同。使用本實(shí)驗(yàn)室自制的兔抗HMGN2多克隆抗體對(duì)HLP-3p21用做Western blot，結(jié)果顯示HLP-3p21蛋白條帶處有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，我們判斷HLP-3p21抗菌活性分子
[Abstract]:Human LAK cells (lymphocyte-activated killer cells, lymphokine-activated killer cells) / NK cells, CTL cells are considered to be the main immune cell population of anti-tumor cell system and anti-microorganism infection. There are many bactericidal active substances in LAK. Perforin, granzyme and granolysin have been found in LAK cells. LL-37, 偽-defensin and other antimicrobial molecules. It is not clear whether there are other endogenous antimicrobial peptides in LAK cells. Human LAK cells stimulated by rIL-2,PHA for one week were incubated with 5% acetic acid homogenate to prepare acid soluble crude extracts. Three groups of bactericidal polypeptides were detected by AU-PAGE and electrophoresis gel agarose dispersion, respectively named HLP-1,. HLP-2,HLP-3. The three components were preliminarily separated by AU-PAGE electrophoresis. The three components were further separated and purified by reverse performance liquid chromatography. The antimicrobial activity of the purified components was screened by agarose dispersion method. The molecular weight and purity of the components with strong antibacterial activity were determined by Tricine-SDS-PAGE electrophoresis. The N-terminal amino acid sequence of highly purified protein component HLP-3p21, was determined by Edman degradation method. Ten N-terminal amino acid sequences of HLP-3p21 were obtained, namely, proline (Pro,P), lysine (Lys,K), arginine (Arg,). R), lysine (Lys,K), alanine (Ala,A), glutamic acid (Glu,E), glycine (Gly,G), aspartic acid (Asp,D) alanine (Ala,A), lysine (Lys,K). The amino acid sequence was recorded in the (NCBI), of the National Library of Medicine of the United States for short sequence matching human protein database retrieval using Blast search tool. It was found that the sequence was identical to the N-terminal amino acid sequence of human non-histone HMGN2. The accurate molecular weight analysis of HLP-3p21 by mass spectrometry showed that the molecular weight of 9274.04 Da, was the same as that of HMGN2. Using rabbit anti HMGN2 polyclonal antibody made in our laboratory as Western blot, for HLP-3p21, the results showed that there was a strong hybridization signal in the band of HLP-3p21 protein. Based on the above results, we judge the antibacterial activity of HLP-3p21.
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2380303