【摘要】：碳青酶烯類(lèi)抗生素亞胺培南90年代初開(kāi)始用于臨床。由于其出色的酶穩(wěn)定性，對(duì)幾乎所有的腸桿菌科細(xì)菌有著強(qiáng)大的抗菌作用，是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)等多重耐藥革蘭陰性桿菌的重要藥物。然而隨著該藥在臨床的使用，1991年日本發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)IMP-1金屬酶的耐藥株，以后各種產(chǎn)IMP和VIM類(lèi)型金屬酶的耐藥株和由于外排泵和孔蛋白改變導(dǎo)致的耐藥株在世界各地被不斷發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥已經(jīng)成為抗感染治療的棘手難題。 目前已知細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的重要原因。為了解耐碳青霉烯類(lèi)抗生素革蘭陰性桿菌的耐藥機(jī)制，我們收集了2003年6月至2004年9月復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素(亞胺培南或美羅培南)耐藥的菌株，包括銅綠假單胞菌79株、其它假單胞菌13株、不動(dòng)桿菌7株和弗勞地檸檬酸桿菌8株共107株，研究了這些耐碳青霉烯類(lèi)菌株的耐藥性、同源性、產(chǎn)碳青霉烯酶的基因型、耐藥基因的基因定位和產(chǎn)其他β內(nèi)酰胺酶特征。 第一部分 耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶的檢測(cè)、分布和分型 采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)定包括亞胺培南和美羅培南在內(nèi)的14種抗菌藥物對(duì)107株耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性桿菌的最低抑菌濃度。結(jié)果顯示107株細(xì)菌中有75株銅綠假單胞菌、10株其它假單胞菌、6株不動(dòng)桿菌和8株弗勞地檸檬酸桿菌共99株細(xì)菌亞胺培南對(duì)其MIC≥8μg／ml。其中75株耐亞胺培南銅綠假單胞菌和10株耐亞胺培南其它假單胞菌中 分別有13株和3株對(duì)美羅培南敏感，但耐亞胺培南不動(dòng)桿菌和弗勞地檸檬酸桿菌對(duì)美羅培南亦全部耐藥。應(yīng)用改良Hodge試驗(yàn)和乙二胺四乙酸(EDTA)協(xié)同試驗(yàn)法對(duì)上述耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性桿菌進(jìn)行碳青霉烯酶篩選，同時(shí)用bla_(VIM-1)、bla_(VIM-2)、bla_(IMP-1)、bla_(IMP-2)、bla_(SPM)、bla_(OXA-23)6組碳青霉烯酶引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其中的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示4株亞胺培南敏感和75株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌Hodge試驗(yàn)均陰性或可疑陽(yáng)性；EDTA協(xié)同試驗(yàn)在75株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中檢出2株產(chǎn)金屬碳青霉烯酶；經(jīng)PCR擴(kuò)增及雙脫氧鏈末端終止法DNA測(cè)序分析為VIM—2型金屬β內(nèi)酰胺酶。10株耐亞胺培南的假單胞菌屬細(xì)菌中2株Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性；EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢出為產(chǎn)金屬碳青霉烯酶，均為惡臭假單胞菌；經(jīng)PCR擴(kuò)增及雙脫氧鏈末端終止法DNA測(cè)序分析亦為VIM—2型金屬碳青霉烯酶。6株對(duì)亞胺培南耐藥的不動(dòng)桿菌Hodge試驗(yàn)均陽(yáng)性，但EDTA協(xié)同試驗(yàn)示陰性，PCR擴(kuò)增及雙脫氧鏈末端終止法DNA測(cè)序分析，6株均為OXA—23型酶，屬絲氨酸碳青霉烯酶。全部8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌均檢測(cè)到IMP金屬酶新亞型，其Hodge試驗(yàn)均陽(yáng)性，EDTA協(xié)同試驗(yàn)呈陽(yáng)性，PCR擴(kuò)增及雙脫氧鏈末端終止法DNA測(cè)序分析顯示為IMP金屬酶新亞型。上述結(jié)果表明耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性桿菌中存在產(chǎn)金屬碳青霉烯酶(IMP／VIM)或絲氨酸碳青霉烯酶(OXA—23)的克隆株。上述18株產(chǎn)不同型別碳青霉烯酶的革蘭陰性桿菌除1株瓊氏不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素B顯示耐藥外，其他菌株對(duì)該藥均顯示敏感。這些菌株對(duì)其他受試的抗菌藥物包括第三、四代頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)以及碳青霉烯類(lèi)均顯示耐藥(6株不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮／舒巴坦復(fù)方制劑敏感)。產(chǎn)碳青霉烯酶是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的重要原因之一。其中產(chǎn)OXA—23型碳青霉烯酶是導(dǎo)致不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯抗生素耐藥的主要原因。產(chǎn)IMP新亞型金屬酶是導(dǎo)致弗勞地檸檬酸桿菌對(duì)碳青霉烯抗生素耐藥的主要原因。但對(duì)銅綠假單胞菌而言，產(chǎn)碳青霉烯酶可能不是導(dǎo)致其碳青霉烯類(lèi)耐藥的主要原因。75株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，僅2株檢出VIM—2型金屬β內(nèi)酰胺酶。 第二部分 耐碳青霉烯類(lèi)不動(dòng)桿菌的β內(nèi)酰胺酶研究 對(duì)上述經(jīng)EDTA協(xié)同試驗(yàn)顯示陰性，改良Hodge試驗(yàn)顯示陽(yáng)性、PCR反應(yīng)及DNA序列分析為產(chǎn)OXA—23型酶的6株不動(dòng)桿菌(3株瓊氏不動(dòng)桿菌、3株鮑曼不動(dòng)桿菌)進(jìn)一步進(jìn)行等電聚焦電泳(IEF)測(cè)定產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶等電點(diǎn)，bla_(TEM)，bla_(SHV)，bla_(CTX-M-Ga～Gc)，bla_(OXA-23)，bla_(MBL)等引物的聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測(cè)和基因分型，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序；質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)和Southern Blot進(jìn)行OXA—23的基因定位；脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)研究耐碳青霉烯類(lèi)不動(dòng)桿菌的同源性。結(jié)果顯示6株產(chǎn)OXA—23型碳青酶烯酶耐藥不動(dòng)桿菌中，有5株細(xì)菌同時(shí)產(chǎn)PER—1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。等電點(diǎn)測(cè)定pI5.3為PER—1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，pI6.65為OXA—23型 碳青酶烯酶；質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)未獲成功；Southern Blot試驗(yàn)結(jié)果顯示6株細(xì)菌的bla_(OXA-23)均定位于染色體。脈沖場(chǎng)電泳結(jié)果顯示3株瓊氏不動(dòng)桿菌屬于同一PFGE分型，3株鮑曼不動(dòng)桿菌分別屬于2種PFGE分型。結(jié)合6株不動(dòng)桿菌感染患者的臨床資料，提示存在耐藥克隆的傳播。14種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示5株不動(dòng)桿菌對(duì)多粘菌素B敏感，MIC為0.5mg／L—2mg／L；多粘菌素B對(duì)不動(dòng)桿菌A7的MIC為8mg／L。此外6株耐碳青霉烯類(lèi)不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南等其他13種抗菌藥物均耐藥，顯示產(chǎn)OXA—23型碳青酶烯酶是導(dǎo)致不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要原因。酶抑制劑舒巴坦可使頭孢哌酮單藥MIC＞128mg／L下降到聯(lián)合后的4／2～16／8mg／L。 第三部分 耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的研究 對(duì)上述經(jīng)改良Hodge test和EDTA協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性、PCR反應(yīng)及DNA序列分析為產(chǎn)IMP型金屬碳青霉烯酶新亞型的8株弗勞地檸檬酸桿菌，進(jìn)一步采用等電聚焦電泳(IEF)測(cè)定其產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的等電點(diǎn)，bla_(TEM)，bla_(SHV)，bla_(CTX-M-G1～G3)，bla_(AmpC)，bla_(MBL)等引物的聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測(cè)和基因分型，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序；質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)和Southern Blot進(jìn)行IMP新亞型酶基因的基因定位；脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)研究耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌的同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌均產(chǎn)TEM—1型β內(nèi)酰胺酶，CTX—M—14型ESBLs及IMP型金屬酶新亞型，其中4株同時(shí)產(chǎn)CTX—M—3型ESBLs。未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的頭孢菌素酶。等電點(diǎn)測(cè)定pI5.25為T(mén)EM-1酶、pI8.1為CTX-M-14型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，pI8.6為CTX-M-3型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，IMP新亞型碳青酶烯酶的pI在8.1-8.6之間；質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)未獲成功；所有菌株的PFGE譜型均屬同一譜型。結(jié)合臨床資料，8株細(xì)菌均分離自華山醫(yī)院神經(jīng)外科病房的患者尿液，提示該病區(qū)內(nèi)可能存在耐藥克隆的傳播。對(duì)包括亞胺培南和美羅培南在內(nèi)的14種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌除對(duì)多粘菌素B(MIC為0.5mg／L-1mg／L)敏感外，對(duì)其他亞胺培南和美羅培南等13種抗菌藥物均耐藥，且耐藥程度較高。除環(huán)丙沙星的MIC為32mg／L～64mg／L外，其他抗菌藥物的MIC大多均≥128mg／L，耐藥譜相似。顯示產(chǎn)IMP新亞型金屬酶是導(dǎo)致弗勞地檸檬酸桿菌對(duì)包括碳青霉烯類(lèi)在內(nèi)的所有受試β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥的重要原因；細(xì)菌同時(shí)產(chǎn)多種β-內(nèi)酰胺酶，包括CTX—M型ESBLs等可能亦是導(dǎo)致該類(lèi)細(xì)菌耐藥程度高的綜合因素。 第四部分 IMP新亞型金屬酶基因的定位、克隆和表達(dá) 應(yīng)用質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究上述8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥性的傳播特征；采用隨機(jī)引物標(biāo)記法制備IMP新亞型基因探針，Southern blot對(duì)上述8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌進(jìn)行IMP新亞型基因定位；通過(guò)將IMP新亞型基因在體外與載體PUC18連接轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α，測(cè)定11種抗菌藥物對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的MIC，進(jìn)行IMP新亞型基因的克隆、表達(dá)及DNA測(cè)序分析；同時(shí)結(jié)合PCR擴(kuò)增檢測(cè)1、2、3類(lèi)整合子研究IMP新亞型基因的傳播機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，，接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)未獲含IMP新亞型的轉(zhuǎn)移接合子；電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)同樣未獲含IMP新亞型的轉(zhuǎn)化子，但獲得含CTX-M-14型的轉(zhuǎn)化子；提示IMP新亞型基因可能位于染色體。Southern blot試驗(yàn)證實(shí)該IMP新亞型基因位于染色體上。DNA測(cè)序結(jié)果示該IMP新亞型基因與IMP-8和IMP-20各差1個(gè)堿基，與IMP-19差2個(gè)堿基。含體外重組PUC18_(IMP)新亞型質(zhì)粒的大腸埃希菌轉(zhuǎn)化子EDTA協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，顯示產(chǎn)金屬碳青霉烯酶；測(cè)定包括碳青霉烯類(lèi)藥物亞胺培南、美羅培南，頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟等第三、第四代頭孢菌素，氨曲南，以及阿米卡星、環(huán)丙沙星等11種抗菌藥物對(duì)36株轉(zhuǎn)化子的MIC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶對(duì)轉(zhuǎn)化子的MIC較對(duì)受體細(xì)胞大腸埃希菌DH5α增加3個(gè)對(duì)倍稀釋度或以上；亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟的MIC增加1～2個(gè)對(duì)倍稀釋度，而哌拉西林、氨曲南、阿米卡星、環(huán)丙沙星的MIC未見(jiàn)增加。對(duì)8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌檢測(cè)1、2、3類(lèi)整合子的結(jié)果顯示：8株耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌均含1類(lèi)整合子，不含2、3類(lèi)整合子；進(jìn)一步將1類(lèi)整合酶的引物INT1F與IMP新亞型引物IMP-2n-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果陽(yáng)性；該擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序結(jié)果示該DNA序列中含IMP新亞型基因及59be結(jié)構(gòu)，說(shuō)明IMP新亞型基因位于1類(lèi)整合子，其位置緊鄰1類(lèi)整合酶及AttI位點(diǎn)旁，與1類(lèi)整合子關(guān)系密切，臨床菌株對(duì)亞胺培南和美羅培南等碳青霉烯類(lèi)高度耐藥可能與之有關(guān)。IMP新亞型基因下游為AAC6基因。 綜上所述，細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶是細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的重要原因之一。尤其是耐碳青霉烯不動(dòng)桿菌和耐碳青霉烯類(lèi)弗勞地檸檬酸桿菌。華山醫(yī)院的耐碳青霉烯類(lèi)革蘭陰性桿菌中，銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌主要產(chǎn)VIM-2金屬碳青霉烯酶，弗勞地檸檬酸桿菌主要產(chǎn)IMP新亞型金屬碳青霉烯酶，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌主要產(chǎn)OXA-23型絲氨酸碳青霉烯酶。在華山醫(yī)院的某些病房存在上述產(chǎn)VIM-2、IMP新亞型和OXA-23型碳青霉烯酶革蘭陰性桿菌克隆株；這些細(xì)菌不但對(duì)亞胺培南、美羅培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟等第三、四代頭孢菌素及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥，并且對(duì)氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)耐藥，臨床治療困難。除產(chǎn)碳青霉烯酶外，上述菌株還可產(chǎn)生PER-1、CTX-M-3和CTX-M-14型等多種ESBLs，可能亦是導(dǎo)致該類(lèi)細(xì)菌耐藥程度高的原因之一。編碼碳青霉烯酶的基因IMP新亞型和OXA-23基因位于染色體。含體外重組PUC18_(IMP)新亞型質(zhì)粒的大腸埃希菌轉(zhuǎn)化子可表達(dá)產(chǎn)IMP新亞型金屬碳 青霉烯酶及對(duì)抗菌藥物的耐藥性，但亞胺培南和美羅培南的MIC較臨床株為低。IMP新亞型基因位于1類(lèi)整合子，緊鄰1類(lèi)整合酶及AttI位點(diǎn)，推測(cè)與臨床菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)高度耐藥有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱德妹,汪復(fù),張嬰元;2003年上海地區(qū)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J];中國(guó)抗感染化療雜志;2005年01期

本文編號(hào)：2380656