【摘要】： TNF-α(tumor necrosis factor, TNF-α)主要由活化的T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生并分泌,具有多種不同的生物學(xué)功能。它以?xún)煞N生物活性形式存在:26kD的跨膜型TNF-α(mTNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(sTNF-α)。mTNF-α是sTNF-α的前體,在TNF-α轉(zhuǎn)換酶(TACE)的作用下,其胞外段被切割,脫落成sTNF-α。 近年研究發(fā)現(xiàn),mTNF-α和其受體結(jié)合后,不僅可以啟動(dòng)受體后的信號(hào)傳導(dǎo),即正向信號(hào),而且能向自身所在的細(xì)胞傳遞信號(hào),即“反向信號(hào)”(reverse signaling),并引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明,mTNF-α反向信號(hào)的產(chǎn)生、傳遞與其胞漿段的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。mTNF-α的信號(hào)肽(signal peptide,SP)由76個(gè)氨基酸組成,包括連接段,跨膜段和胞漿段,其胞漿段參與mTNF-α反向信號(hào)的傳遞,但是其反向信號(hào)通路尚不清楚。 TRAF(Tumor necrosis factor receptor associated factor)是一類(lèi)與TNFR超家族成員直接或間接結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)接頭分子,迄今已發(fā)現(xiàn)六種哺乳動(dòng)物的TRAF家族成員,可誘導(dǎo)多種激酶的活化,最終介導(dǎo)一系列信號(hào)傳遞途徑如NF-κB、JNK等,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,分化和凋亡。運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù),我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TRAF1可與mTNF-α共沉淀,提示TRAF1可能與mTNF-α的胞漿段以直接或間接的方式結(jié)合,傳遞反向信號(hào)。 本課題借助分子生物學(xué)的方法構(gòu)建TNF-SP-EGFP重組質(zhì)粒,與TRAF1-pDsRedN1,瞬間共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系COS-7,研究TNF-SP和TRAF1二者在細(xì)胞內(nèi)的共定位,從而為進(jìn)一步闡明mTNF-α反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 一. TNF-SP-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆及鑒定 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建和克隆:以TNF-SP-PcDNA3.0質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增獲取TNF-SP目的基因,用EcoRI和BamHI對(duì)目的基因和pEGFP-N1載體進(jìn)行雙酶切,并用T4DNA連接酶連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,挑選陽(yáng)性克隆。 2.陽(yáng)性克隆的鑒定:以菌落PCR初步篩選陽(yáng)性克隆,再用上述限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切鑒定,結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒經(jīng)酶切得到228bp的目的片斷,與所連接的目的基因大小一致。進(jìn)一步DNA測(cè)序分析,證實(shí)重組質(zhì)粒包含TNF-SP的編碼區(qū),且無(wú)突變和移碼。提示TNF-SP-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 二.TNF-SP-EGFP融合蛋白在真核細(xì)胞的表達(dá)及定位 將TNF-SP-EGFP融合蛋白重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)EGFP的綠色熒光及與TNF-SP特異性結(jié)合抗體上標(biāo)記的紅色熒光,說(shuō)明TNF-SP-EGFP融合蛋白在COS-7細(xì)胞中成功表達(dá)。將所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行PI染色,并在激光共聚焦顯微鏡下觀察,顯示綠色熒光呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞漿,說(shuō)明TNF-SP-EGFP融合蛋白在細(xì)胞漿表達(dá)。而間接熒光則顯示TNF-SP也可在細(xì)胞膜上表達(dá)。 三.TNF-SP與TRAF1的細(xì)胞內(nèi)共定位 將TNF-SP-EGFP與TRAF1-pDsRedN1共同轉(zhuǎn)染于COS-7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)TNF-SP-EGFP與TRAF1-pDsRedN1發(fā)生熒光重疊,顯示為黃色熒光,提示TNF-SP與TRAF1共定位于細(xì)胞漿, SP可能與TRAF1的N端結(jié)合。 結(jié)論:1.成功構(gòu)建了TNF-SP-EGFP重組質(zhì)粒,且在COS-7真核細(xì)胞中得以表達(dá)。2.間接免疫熒光方法和激光共聚焦顯微鏡顯示TNF-SP表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。3.初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-SP與TRAF1共定位于細(xì)胞漿,且TNF-SP可能與TRAF1蛋白N末端結(jié)合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2350910